Avances tecnológicos en microscopía de fluorescencia
Introducción
La microscopía de fluorescencia (MF) ha revolucionado la investigación en life science. Ofrece una visión sin precedentes de las estructuras y procesos biológicos dinámicos, transformando nuestra comprensión de la organización celular y subcelular, los mecanismos, las interacciones y el desarrollo. Aunque existe desde hace más de 100 años, los extraordinarios avances tecnológicos de los últimos 30 años han afianzado a la MF como una herramienta de imagen potente y asequible, accesible a prácticamente cualquier laboratorio.
El auge de la microscopía de fluorescencia
La historia de la microscopía de fluorescencia se define por un impulso sostenido de innovación salpicado de momentos clave. Los primeros microscopios de fluorescencia, creados a partir de la aparición de los microscopios UV a principios del siglo XX, convirtieron en acción cinco décadas de especulaciones y debates. En las décadas de 1940 y 1950, el inmunólogo Albert Coons y sus colegas conjugaron compuestos fluorescentes (fluoróforos) con anticuerpos primarios y secundarios para detectar antígenos, lo que dio origen a la moderna obtención de imágenes por inmunofluorescencia (IF). El descubrimiento por Osamu Shimomura en 1961 de la proteína verde fluorescente (GFP) en medusas proporcionó otra herramienta clave para la MF, aunque no se haría realidad hasta pasadas tres décadas. La primera versión del microscopio de epifluorescencia actual apareció en 1967 con la introducción de los espejos dicroicos de división de haces por Brumberg y Ploem.
Una explosión en la diversidad de marcadores fluorescentes en la década de 1990 marcó un punto de inflexión y el comienzo de un rápido desarrollo tecnológico que condujo a una expansión masiva de las aplicaciones de MF. La secuenciación de la GFP y la posterior expresión transgénica introdujeron nuevas oportunidades en la obtención de imágenes fluorescentes, permitiendo el etiquetado altamente selectivo de organismos vivos. Rápidamente se desarrollaron numerosas variantes y otras proteínas fluorescentes, mientras que las mejoras y la diversificación simultáneas de los fluoróforos sintéticos impulsaron la IF y otras aplicaciones que antes se veían obstaculizadas por las limitaciones de los tintes. Los nuevos colorantes, como los ampliamente conocidos Alexa Fluor, eran más fotoestables, insensibles al pH y más brillantes, y mantenían su brillo cuando se conjugaban. El consiguiente aumento de la gama espectral y la diversidad de fluoróforos aportó más flexibilidad, imágenes más profundas y mejores capacidades de multiplexación.
En las últimas décadas, las innovaciones en microscopios, sistemas de iluminación, métodos, química y procesamiento de imágenes han continuado su rápido ritmo, permitiendo estudios cada vez más complejos y de mayor resolución. Por ejemplo, las interacciones celulares o moleculares rápidas pueden observarse fácilmente en tiempo real con una alta resolución espacial y temporal utilizando configuraciones de sobremesa asequibles.
Consideraciones sobre el diseño de la fluorescencia
El éxito de los estudios de imágenes de fluorescencia depende en gran medida de la selección de la etiqueta y de la tecnología de MF. La elección del marcador se rige por consideraciones complejas, incluidos factores interconectados relacionados con el experimento, la tecnología utilizada y el nivel de sensibilidad y especificidad requerido. Los fluoróforos sintéticos suelen conjugarse con moléculas diana, como anticuerpos u otras proteínas y oligonucleótidos, y se presentan en una amplia gama de reactivos fluoróforos y conjugados prefabricados. Los marcadores fluorescentes pueden interferir potencialmente con la función, localización o dinámica de una diana, por lo que deben considerarse cuidadosamente para su aplicación y funcionalidad.
La multiplexación utiliza conjuntos complementarios de marcadores para obtener imágenes de múltiples objetivos o eventos simultáneamente. Es esencial para muchos estudios, pero requiere consideraciones adicionales, como la intensidad relativa de la señal y el potencial de reactividad cruzada. El mapeo de los espectros de excitación y emisión de los fluoróforos para evitar el solapamiento espectral es fundamental para obtener datos fiables y se ha simplificado con Fluorescence SpectraViewer, una herramienta en línea gratuita.
Los anticuerpos siguen siendo el método de marcaje más utilizado para la MF, normalmente utilizando anticuerpos primarios que se unen al antígeno diana, que a su vez es unido por anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se dirigen a la especie huésped del anticuerpo primario y a la clase de inmunoglobulina. Si es necesario, las dianas de baja abundancia pueden amplificarse aún más con proteínas de unión a biotina, como la estreptavidina, u otros métodos como la amplificación de señal de tiramida (TSA). En ciertos casos, el marcaje directo con anticuerpos primarios conjugados puede simplificar o mejorar los protocolos, en particular para el multiplexado.
Los anticuerpos deben validarse tanto para la especificidad como para el rendimiento de la aplicación (por ejemplo, inmunohistoquímica (IHC) o inmunocitoquímica) para garantizar resultados precisos y repetibles. La adsorción cruzada para eliminar la reactividad cruzada mejorará el rendimiento, especialmente en los estudios de multiplexación. El uso de diferentes especies para los anticuerpos primarios también es necesario para evitar la reactividad cruzada.
Muchas tecnologías de MF varían predominantemente en sus sistemas de iluminación y detector. Los microscopios de epifluorescencia de campo amplio son las plataformas más sencillas, versátiles y más utilizadas, y tradicionalmente utilizan una fuente de luz intensa de amplio espectro con filtros ópticos para iluminar la muestra. Son rápidos, fáciles de usar, asequibles y ofrecen una calidad de imagen y una resolución suficientes para muchas aplicaciones. Su rápida capacidad de obtención de imágenes a bajas intensidades de luz las hace ideales para la obtención de imágenes de células vivas, especialmente si se potencian con modernas fuentes de luz LED. La microscopía óptica de seccionamiento, como la microscopía confocal de lámina de luz y la microscopía multifotónica, incorporan iluminación láser de alta intensidad y limitan la detección al plano focal. Esto permite la creación de un conjunto de datos tridimensionales mediante la adquisición de múltiples planos en la dimensión z y reduce la fluorescencia de fondo para obtener imágenes de mayor resolución. Los microscopios de lámina de luz iluminan las muestras sólo a lo largo del plano focal, utilizando una fina lámina de excitación láser perpendicular a la captura de imágenes para obtener imágenes muy rápidas. Algunos instrumentos son multimodales, con capacidad para cambiar los métodos de iluminación y/o detección. Incluso dentro de un mismo tipo de tecnología, los instrumentos varían en parámetros importantes como la sensibilidad y la eficiencia, que repercuten en la calidad de los datos y el diseño de los estudios.
Tendencias recientes
Un enfoque cada vez mayor en la biología de sistemas y la necesidad de observar más de seis objetivos simultáneamente ha impulsado una mayor capacidad de multiplexación, limitada durante mucho tiempo por el solapamiento espectral en las paletas de fluorescencia. Las nuevas técnicas y la capacidad de cálculo han dado lugar a imágenes "supermultiplexas" y "ultramultiplexas" de 15 o más objetivos. Estas metodologías explotan características contrastadas alternativas de colorantes con espectros de emisión solapados, por ejemplo, midiendo las vibraciones de enlaces químicos o la estabilidad temporal y/o aplicando técnicas algorítmicas avanzadas de desmezcla espectral.
El desarrollo y uso de la iluminación de fuentes LED en MF ha experimentado un rápido aumento, con una nueva tecnología de diodos y una potencia cada vez mayor que alimentan su creciente relevancia en diversas aplicaciones. Varias ventajas importantes sobre las fuentes tradicionales de lámparas de arco contribuyen a su popularidad. La irradiancia (intensidad luminosa) de los LED rivaliza ahora con la de las lámparas de arco para aplicaciones MF de campo amplio, pero es regulable, lo que elimina la necesidad de filtros de densidad neutra. La velocidad de captura de imágenes aumenta sin necesidad de obturadores ni ruedas de filtros, ya que las luces pueden encenderse y apagarse con una precisión de microsegundos y los filtros pueden aplicarse en diodos individuales. La iluminación con fuentes LED también es más sostenible, con una vida útil al menos 1-2 órdenes de magnitud superior a la de las lámparas de arco, una décima parte del consumo de energía y ninguno de los peligros para la salud, la seguridad y el medio ambiente del mercurio presente en las lámparas de arco.
Un aspecto importante de la iluminación con fuentes LED es la reducción de la intensidad, la duración y la cantidad de exposición a la luz de las muestras, mejorando así la intensidad de la señal, reduciendo el ruido y minimizando los daños a las muestras. Los diodos están disponibles en canales de longitud de onda discretos que abarcan desde los 340 nm (UV) hasta los 780 nm (IR cercano) para una iluminación selectiva y multicanal de longitud de onda que se adapta a una gran variedad de aplicaciones, como la captura de imágenes de células vivas a alta velocidad, la captura de imágenes de calcio, la optogenética y la transferencia de energía por resonancia de Förster, entre otras. Aplicada con frecuencia a la microscopía de superresolución como iluminación de apoyo para previsualizar regiones de interés, la iluminación LED también se ha aplicado con éxito a la microscopía de iluminación estructurada con velocidad de adquisición limitada por la cámara. La iluminación de volumen selectiva modulada espacialmente con una fuente LED también ha proporcionado resultados similares a la microscopía de lámina de luz. Aunque todavía muy limitada en su capacidad para enfrentarse a la iluminación láser en MF, la luz LED de baja coherencia produce menos artefactos de moteado o sombras que los haces láser de alta coherencia, lo que tiene el potencial de mejorar la calidad de la imagen.
Desafíos actuales e innovaciones
Daños en la imagen
El fotoblanqueamiento (daño inducido por la luz en los fluoróforos) y la fototoxicidad (daño inducido por la luz en las células vivas) son problemas constantes en la mayoría de las aplicaciones de MF y dependen tanto de la duración como de la intensidad de la iluminación de excitación. El fotoblanqueo impide permanentemente la fluorescencia y está causado por cambios inducidos por fotones en la estructura molecular del fluoróforo. La fototoxicidad puede afectar negativamente al crecimiento, la replicación, la función y la viabilidad de las células. La mayoría de las tácticas de mitigación para ambos giran en torno a la limitación de la exposición a la luz a través de controles temporales, espaciales, de intensidad y espectrales.
Los controles de iluminación tradicionales pueden incluir obturadores y filtros para la longitud de onda, la intensidad de la luz (densidad neutra), el bloqueo de los rayos UV y el calor. Por el contrario, la amplia reducción de la exposición a la luz que ofrecen las fuentes LED programables y altamente controladas las ha convertido en un recurso inestimable para la obtención de imágenes en directo. Aunque lo mejor es una iluminación más prolongada a menor intensidad, la luz pulsada o estroboscópica de alta intensidad causa menos fotodaño que la luz sostenida de alta intensidad debido al período de reposo de los fluoróforos excitados. Las tecnologías MF que limitan la iluminación al plano focal, como la lámina de luz y la reflexión interna total, constituyen las opciones más suaves y eficientes desde el punto de vista lumínico. Las longitudes de onda más largas (por ejemplo, rojo-IR), como las que se utilizan para la microscopía multifotónica, son considerablemente menos dañinas que las longitudes de wa de mayor energía (por ejemplo, UV-azul).
La elección de fluoróforos con fotoestabilidad mejorada reducirá el fotoblanqueo y la fototoxicidad asociada. Además, una mejor eficiencia de detección puede permitir imágenes de mayor relación señal-ruido con una iluminación de excitación más baja. Por último, los reactivos antidesvanecimiento pueden reducir significativamente el fotoblanqueo tanto en muestras vivas como fijas, preservando la intensidad de la señal a lo largo del tiempo y en todo el espectro. Las soluciones antidesvanecimiento también pueden reducir la fototoxicidad en algunos tipos de muestras.
Imagen de células vivas
Trabajar con células vivas conlleva muchos de sus propios retos. Las células vivas deben mantenerse en su estado fisiológico natural y en condiciones saludables para producir resultados biológicamente relevantes. Las funciones y los procesos celulares son muy sensibles a condiciones variables, como la temperatura, el pH y el oxígeno, que deben controlarse estrictamente para obtener resultados fiables y repetibles. Se necesita un incubador de células vivas cuando los requisitos de temperatura y/o mezcla de gases de las células difieren significativamente del entorno ambiental. Las soluciones de medios comerciales también pueden ayudar a mantener la viabilidad celular durante la carga del colorante, los lavados y la obtención de imágenes en condiciones ambientales, al tiempo que aumentan la claridad de la imagen y la relación señal/ruido.
Algunas técnicas de fluorescencia son intrínsecamente nocivas para las células o las muestras de tejido, lo que impulsa continuas innovaciones en la iluminación, como se ha comentado anteriormente, así como en los marcadores. Los marcadores fluorescentes pueden ser tóxicos para las células vivas: la fototoxicidad de los fluoróforos se debe a la irradiación y a la subsiguiente formación de especies reactivas de oxígeno dentro de la célula, mientras que la quimiotaxicidad se debe a la naturaleza química del propio fluoróforo. La toxicidad varía según el marcador, el tipo de célula y el organismo, por lo que debe evaluarse durante las fases de planificación. El uso de colorantes más eficientes o de imágenes más sensibles que permiten concentraciones reducidas de colorante ha sido un factor importante para limitar la toxicidad de los marcadores.
Permeabilidad
La permeabilidad puede ser un reto trabajando con células fijas o vivas. Aumentar la permeabilidad de las células fijadas manteniendo la integridad de las estructuras puede ayudarse y simplificarse enormemente con kits de fijación y permeabilización. El marcaje de células vivas plantea un reto mayor, ya que las membranas celulares no suelen ser permeables a los anticuerpos y la permeabilización dañará o destruirá las células vivas. Los anticuerpos pueden seguir utilizándose para teñir las membranas celulares o rastrear los procesos de internalización, o mediante la expresión de intracuerpos (anticuerpos intracelulares). Con mayor frecuencia, las células vivas se etiquetan mediante el uso de proteínas fluorescentes dirigidas o pequeños reactivos permeantes de membrana. Las proteínas fluorescentes suelen introducirse en las células vivas como construcciones genéticas a través de medios como la transfección lipídica o la transducción viral, tras lo cual se expresa el ADN exógeno.
El etiquetado de células vivas puede facilitarse considerablemente mediante una serie de reactivos comerciales. Por ejemplo, los reactivos CellLight contienen construcciones listas para su uso, utilizadas principalmente para el marcaje de orgánulos, que pueden añadirse a un cultivo para que las células las absorban la noche anterior a la obtención de imágenes, de forma similar a una tinción, lo que elimina la necesidad de utilizar técnicas de biología molecular. Otra opción para el marcaje intracelular son los colorantes permeables a las células que forman productos de reacción impermeables en su interior, como los reactivos CellTracker. Los fluorógenos como los indicadores pHrodo que funcionan como sensores de pH intracelular, particularmente útiles para estudios de endocitosis, fagocitosis y secuestro, pueden utilizarse en una variedad de formatos para diferentes aplicaciones, como un colorante para medir el pH citosólico o conjugado con ligandos, anticuerpos u otras partículas para facilitar los estudios de internalización.
Aumento de la relación señal/ruido
La mejora de la relación señal/ruido (SNR), siempre una preocupación en la investigación, afecta a la resolución práctica, la precisión y la confianza en los resultados; también tiene uno de los impactos más directos en la calidad de imagen percibida. La SNR depende en gran medida del microscopio, incluida su iluminación, lentes objetivo, detectores y alineación, por lo que la tecnología es un factor vital en la planificación. Además, la SNR también se ve afectada por la densidad y/o el brillo del fluoróforo. La optimización de la iluminación y de los marcadores, incluidos los conjugados y los espectros de excitación/emisión, puede mejorar considerablemente la SNR.
Los reactivos comerciales múltiples también pueden contribuir a la optimización de la SNR mediante la amplificación de la señal o la supresión del ruido. La señal para dianas de muy baja abundancia puede aumentarse con TSA, que ofrece amplificación de alta claridad y alta definición. La combinación del tratamiento TSA con colorantes de alto rendimiento puede aumentar la sensibilidad y la precisión entre 10 y 200 veces respecto a los métodos estándar. El ruido puede reducirse con soluciones de bloqueo o supresores de fondo. Las proteínas bloqueantes desplazan a los anticuerpos de alta afinidad a la vez que bloquean las interacciones de menor afinidad para reducir la tinción inespecífica. Pueden ser generales o específicos para determinados conjugados, como las proteínas de unión a biotina. Los supresores de fondo generales también pueden ayudar cuando se obtienen imágenes de células vivas en los canales azul, verde y rojo.
Conclusiones
Los avances en los sistemas comerciales han mejorado enormemente la calidad, fiabilidad y asequibilidad de la microscopía de fluorescencia. Muchos de los sistemas más recientes son de alta potencia y fáciles de usar, lo que mejora el acceso a la generación de datos de alta calidad. La línea de microscopios EVOS ofrece funciones adicionales para películas automatizadas de lapso de tiempo, escaneado de placas de múltiples pocillos, unión y mosaico de imágenes y recuento de células en un sistema modular y asequible. Viene equipado con fuentes de luz LED brillantes y de larga duración en configuraciones de cubo de luz de campo amplio y flexibles e intercambiables con filtros de alto rendimiento optimizados para tintes específicos, que producen una SNR alta e imágenes listas para publicación para una amplia gama de fluoróforos.
La microscopía de fluorescencia forma parte integral de la investigación de la biología espacial y funcional y lleva décadas contribuyendo a remodelar la investigación en campos fundamentales de las ciencias de la vida. El asombroso ritmo de crecimiento y desarrollo sigue permitiendo nuevas ramas de investigación con capacidades en rápida expansión. Las mejoras en los instrumentos y la química, junto con los sistemas de iluminación más seguros, duraderos y consistentes, añaden potencia y asequibilidad a las configuraciones de sobremesa, permitiendo la accesibilidad global de herramientas de investigación y diagnóstico que cambian el régimen. El futuro es brillante.
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