La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) es un elemento básico en cualquier laboratorio que trabaje con ácidos nucleicos, como los laboratorios de investigación del cáncer (Consulte aquí nuestras mejores opciones de productos para la investigación del cáncer) capaz de producir mediciones asombrosamente precisas. Sin embargo, muchos científicos siguen teniendo problemas para obtener siempre resultados fiables y reproducibles.
He aquí algunos errores comunes que podrían ser la causa de sus problemas con la qPCR, y nuestras sugerencias para evitarlos.
1. Su muestra está contaminada
Ocurre. El ADN está en todas partes y, a menos que tome las precauciones adecuadas, también acabará en tu muestra. Además, otros contaminantes como la hemoglobina, el etanol y el fenol pueden inhibir la PCR.
Hay muchos puntos en los que la contaminación puede entrar en sus muestras. He aquí algunos consejos para minimizar el riesgo de que una muestra se contamine.
- El primer paso es disponer de un espacio de trabajo limpio. Una cabina para PCR (también conocidos como bancos limpios, campanas de flujo laminar, etc.) es un buen comienzo. Las cabinas para PCR evitan la contaminación de fondo y la contaminación cruzada manteniendo todos los contaminantes del aire alejados de las muestras.
- Todas las superficies del área de PCR deben descontaminarse rutinariamente para evitar la contaminación cruzada, utilizando una solución descontaminante de ADN que destruya el ADN.
- Tenga a mano varios juegos de pipetas y mantenga separadas las pipetas para los distintos pasos del flujo de trabajo.
- Considere la posibilidad de incluir un control de menos transcriptasa inversa (o «control de no amplificación» / NAC) en los experimentos de qRT-PCR. Suele tratarse de una transcripción inversa simulada que contiene todos los reactivos de la RT-PCR excepto la transcriptasa inversa. Si se observa una señal en el NAC, probablemente significa que tiene una contaminación de ADN en su muestra.
- También puede utilizar un espectrofotómetro para hacerse una idea de la concentración y la calidad del ADN. La relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/280) debe estar en el intervalo de 1,8-2,0. Si no es así, es posible que las muestras estén contaminadas con sales, disolventes o proteínas. Si tiene contaminación, ejecute un protocolo de limpieza, como un kit de limpieza.
2. Su muestra se ha degradado
El ARN degradado parece una mancha en un gel de agarosa y no forma bandas de ARN ribosómico reconocibles. Pero, ¿cómo ocurre esto? Bueno, hay varias cosas a tener en cuenta si quiere mantener su muestra en buenas condiciones para pasarla por una PCR.
- Almacene sus muestras adecuadamente. Nunca se insistirá lo suficiente en la importancia de invertir en un almacenamiento adecuado de las muestras. Si son sensibles a algún factor ambiental, debe estar seguro al 100% de que estos factores están bajo control. El almacenamiento de las muestras incluye desde el equipo, hasta los viales, y el tampón, y necesita un sistema para controlar si sus muestras se ven amenazadas por un cambio en el entorno. Especialmente si su muestra es rara, difícil de obtener o cara, no tiene sentido no invertir en cuidarla adecuadamente y utilizar un tampón conservador de ARN. No nos cansaremos de repetirlo. Para obtener los mejores resultados, sus muestras deben estar lo más frescas posible, por lo que debe evitar someterlas a numerosos ciclos de descongelación/congelación.
- Su muestra puede haberse contaminado con enzimas nucleasas. Asegúrese siempre de limpiar correctamente su espacio de trabajo utilizando una solución inactivadora de RNasa. También puede añadir un reactivo como RNAsecure™ a su solución para eliminar el contaminante RNasa en su muestra.
- La mayoría de los kits de PCR comerciales contienen un inhibidor de RNasa, y por una buena razón. Si todavía está utilizando un kit que no contiene uno, puede ser el momento de cambiar a un kit que lo haga.
- Por último, es importante utilizar siempre agua libre de nucleasas. Puedes adquirirla lista para usar o hacerla tú mismo en el laboratorio.
3. No disponer del diseño adecuado de cebadores y sondas
- Para obtener los mejores resultados, es muy recomendable utilizar un software de diseño de cebadores. El NCBI ofrece una plataforma gratuita de diseño de cebadores que puede consultar.
- Cuando diseñe amplicones en dianas eucariotas, elija cebadores de PCR que abarquen al menos una unión exón-exón en el ARNm diana para evitar que la amplificación de la diana contamine el ADN genómico.
- Otro aspecto a tener en cuenta en el diseño de los cebadores son las estructuras primarias y secundarias que pueden afectar a la reacción.
- Lo ideal sería evitar las regiones con muchas repeticiones de pares de bases, pero obviamente esto no siempre es posible.
- Las regiones con más de un 60% de GC pueden ser especialmente complicadas, porque no sólo son bastante termoestables, sino que su «curvabilidad» significa que tienden a formar estructuras secundarias, como horquillas. Por suerte, existen aditivos comerciales que pueden ayudarle a resolver este problema, como la mezcla maestra o la polimerasa correctas.
4. No utilizar Master Mix
Lo que nos lleva al siguiente punto.
qRT-son herramientas extremadamente sensibles y eficientes para amplificar el ARN, lo que es estupendo, hasta que también amplifica los errores. Por supuesto, la variabilidad entre pocillos y muestras debe mantenerse al mínimo, y la reproducibilidad al máximo. Aquí es donde entran en juego las Master Mix come in. Para reducir aún más la variación entre pocillos, se puede añadir a la mezcla maestra un a colorante de referencia como ROX.
5. Error de usuario
Nadie es perfecto y, sobre todo cuando se trata de trabajos complicados y a menudo repetitivos, se cometen errores. Hay algunos errores comunes que pueden producirse, sobre todo cuando se está cansado o hambriento.
¿Se olvidó de añadir algo?
¿Obtiene resultados extraños? ¿Ningún resultado? Es posible que simplemente haya olvidado añadir algo importante a su reacción. Repasa los pasos de nuevo y comprueba si has olvidado algo.
Se han utilizado las condiciones de PCR incorrectas
Muchos termocicladores te dan la opción de guardar tus ajustes personales. Esto es estupendo si tiene varios grupos con protocolos diferentes trabajando en el mismo termociclador y hace que sea mucho más rápido configurar tu experimento cada vez, pero, por supuesto, puede ser una trampa si seleccionas la configuración de guardado incorrecta para tu reacción. Compruebe siempre que ha seleccionado el ajuste correcto antes de empezar.
Temperatura de anillamiento demasiado alta
A veces, determinar la mejor temperatura para una reacción puede resultar complicado. Una buena forma de encontrarla es utilizar un termociclador con función de gradiente. Puede realizar una PCR de gradiente para probar varias temperaturas de anillamiento a la vez, que luego podrás utilizar para comparar y elegir la temperatura que te proporcione la banda deseada más brillante.
Olvidó añadir colorante al gel de agarosa
Si ejecuta un gel y no ve nada en los resultados, es posible que haya olvidado añadir el colorante. Una forma cómoda de evitarlo es adquirir un gel prefabricado que ya contenga el colorante.
Además de estas herramientas y consejos para facilitarle la vida en el laboratorio y reducir las posibilidades de que cometa este tipo de errores, también le recomendamos que haga descansos regulares, duerma lo suficiente, coma y tome vitamina D.