Cómo tener éxito con las aplicaciones de terapia génica cuando la reproducibilidad experimental es crítica
Introducción
Las terapias génicas son muy prometedoras para llevar a cabo tecnologías transformadoras en los próximos años. Estas terapias selectivas y complejas, que suelen funcionar mediante la introducción de vectores que contienen genes en un paciente, tienen el potencial de curar enfermedades raras y difíciles de tratar en toda una serie de áreas médicas. Sin embargo, aún quedan varios retos por resolver antes de que la terapia génica pueda cumplir sus promesas. Uno de los más importantes es la reproducibilidad experimental en las fases de investigación y descubrimiento que suelen tener lugar en un entorno académico. A pesar de la gran importancia de la reproducibilidad, no es raro oír hablar a compañeros científicos que intentan reproducir los resultados de otra persona y fracasan en el intento.
"El éxito de la terapia génica depende del desarrollo de datos reproducibles."
Existen infinidad de enfoques científicos y procedimientos técnicos complejos y, en consecuencia, puede resultar difícil reproducir un resultado experimental. Todas las partes implicadas en el desarrollo y la administración de medicamentos de nueva generación necesitan contar con pruebas sólidas, derivadas de datos, de sus beneficios para respaldar la toma de decisiones y garantizar la traslación de descubrimientos prometedores a terapias eficaces.
Aquí, destacamos algunos obstáculos para lograr la reproducibilidad experimental asociados a los equipos de laboratorio y ofrecemos recomendaciones sobre cómo superarlos. Lograr el máximo nivel de uniformidad entre las prácticas comunes de laboratorio es una necesidad absoluta. Esto significa que los científicos de laboratorio deben estar suficientemente formados y seguir estrictamente los procedimientos correctos para operar y mantener los equipos de laboratorio. En los entornos de investigación académica, estos protocolos son diseñados por los responsables de laboratorio basándose en las recomendaciones que se encuentran en los manuales de usuario proporcionados por los proveedores de equipos. Dado que no existen normas específicas a seguir, las prácticas académicas pueden variar drásticamente. Thermo Fisher Scientific™ reconoce la necesidad de proporcionar apoyo adicional en forma de una variedad de materiales completos, incluyendo notas técnicas, de aplicación e inteligentes para cubrir cada aspecto del uso y mantenimiento de los equipos. Todo ello con el objetivo de permitirle sacar el máximo partido a su equipo y aumentar la reproducibilidad de sus datos experimentales.
Mejora de las prácticas de laboratorio a escala de investigación
Producción de plásmidos
En un entorno académico, los vectores virales que codifican plásmidos suelen producirse en células bacterianas de Escherichia coli, en agitadores orbitales como el Thermo Scientific™ MaxQ 8000 Stackable Shaker. Si el objetivo es conseguir plásmidos de alta calidad, en cantidad y de forma reproducible, es necesario tener en cuenta algunas características clave. Por ejemplo, se ha demostrado que velocidades de agitación de hasta 400 rpm producen mayores rendimientos, y limitar la circulación de microorganismos, que podrían contaminar el cultivo, es importante para garantizar la integridad del producto final. Del mismo modo, las características que facilitan una limpieza fácil y regular garantizan que ninguna superficie albergue contaminantes residuales. Además, la posibilidad de visualizar y modificar simultáneamente los parámetros mientras el agitador está en funcionamiento es beneficiosa para garantizar el control de calidad. Existe una nota inteligente1 dedicada a consideraciones importantes a la hora de evaluar un agitador orbital de gran tamaño para la producción de ADN plasmídico.
Las suspensiones deben agitarse a diferentes velocidades y con diferentes órbitas en función del recipiente de cultivo y el tipo de célula, por lo que elegir el agitador orbital adecuado para su aplicación es fundamental.2 Otros elementos, como la correcta instalación del agitador, el funcionamiento y las mejores prácticas de producción celular, los procesos de limpieza y desinfección y el mantenimiento preventivo periódico también son fundamentales para aumentar la reproducibilidad experimental. 3 Thermo Fisher Scientific™ siempre va un paso por delante y ha invertido mucho tiempo y recursos para optimizar los protocolos más necesarios (por ejemplo, la producción de ADN plasmídico en E. coli4), para que usted no tenga que hacerlo. Puede aumentar la eficiencia y, al mismo tiempo, aumentar la reproducibilidad experimental probando y potencialmente implementando estos protocolos en su laboratorio.
Otras actividades críticas en la preparación de ADN plasmídico son la peletización de células bacterianas y la extracción y purificación de plásmidos. En un entorno académico, la centrifugación sigue siendo la forma más popular y rentable de ejecutar estos pasos. Por ejemplo, el ADN plasmídico puede aislarse en un gradiente de cloruro de cesio, pero este método requiere una ultracentrífuga como la Thermo Scientific™ Sorvall™ WX+ y utiliza bromuro de etidio. Como alternativa, los kits de gravedad o de columna de centrifugación pueden purificar eficazmente el ADN plasmídico en supercentrífugas y microcentrífugas. Para aumentar la reproducibilidad de su protocolo, se puede utilizar una centrifugadora de supervelocidad Thermo Scientific™ Sorvall™ LYNX 6000 y rotores de fibra de carbono Thermo Scientific™ Fiberlite junto con kits de preparación de ADN disponibles en el mercado para obtener ADN plasmídico de alta calidad a gran escala (aproximadamente 1 mg). Por otra parte, existe un método de menor coste sin necesidad de utilizar un kit. Ambos protocolos han sido optimizados y las recomendaciones son fácilmente accesibles a través la nota de aplicación.5 Además, Thermo Fisher Scientific proporciona manuales de usuario completos para todos sus modelos de centrífugas, como para la LYNX,6 que incluyen recomendaciones de desinfección, descontaminación, autoclave y mantenimiento que pueden traducirse sin esfuerzo en procedimientos operativos paso a paso. De este modo, no solo puede aumentar la vida útil de una centrífuga, sino también la tasa de éxito y la reproducibilidad de sus procedimientos de extracción de plásmidos. Además, si está planeando pasar de las operaciones de investigación a un entorno regulado por GLP/GMP en el futuro, entonces Thermo Scientific™ Centri-Log™ Plus Data Management Software7 puede incorporarse a las centrífugas Sorvall™ LYNX con el fin de permitir la recopilación de datos precisos y la trazabilidad en cumplimiento de las normas 21 CFR Parte 11 para el registro electrónico de datos.
Producción de vectores virales
Desarrollar y optimizar su plataforma de producción de lentivirales para crear protocolos de transfección robustos puede llegar a ser muy complicado, especialmente cuando sus prioridades son el alto rendimiento, la escalabilidad y la reproducibilidad. Todos los componentes, incluidos los medios, los reactivos de transfección, los suplementos y las células deben trabajar en perfecta sinergia para generar partículas lentivirales superiores y funcionales. Las aplicaciones de investigación, como la creación de nuevas terapias génicas, dependen en gran medida de un crecimiento celular de alta calidad. Un ejemplo ilustrativo de ello es el uso de un cultivo adhesivo o en suspensión para las células de producción viral HEK 293. Donde, si las células no se cultivan en condiciones óptimas, tanto la lectura experimental como la reproducibilidad se verán afectadas negativamente de formas difíciles de detectar.
Los atributos de calidad del producto celular final, partículas virales, pueden variar enormemente dependiendo de las condiciones de cultivo mantenidas en el incubador de CO2. De hecho, el rendimiento reproducible del cultivo puede verse muy afectado por la implementación de diferentes características y tecnologías en el diseño del incubador de CO2. Como las células responden a señales cambiantes o diferentes, es crucial que las condiciones en la cámara de cultivo sean uniformes de arriba a abajo y de lado a lado, de forma que todas las células experimenten las mismas condiciones. Es aún más importante que el incubador se recupere rápidamente a las condiciones deseadas tras la apertura de la puerta, para que las células pasen el máximo tiempo en sus parámetros ideales, acelerando el tiempo de duplicación y ayudando a garantizar la calidad. Las condiciones ideales para la salud celular y el crecimiento celular no solo están relacionadas con la temperatura, porque el nivel de CO2, el nivel de oxígeno y la humedad relativa (HR) también son importantes, ya que todos desempeñan un papel en la salud celular. Una incubadora que garantice la uniformidad y la rápida recuperación como las incubadoras Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS CO2 y Forma™ Steri-Cycle™ CO2 ayudará a aumentar la reproducibilidad entre lotes. Además, Thermo Fisher Scientific proporciona información sobre las mejores prácticas para el cuidado y mantenimiento adecuados de su incubadora de cultivo celular, incluyendo consejos sobre la instalación y colocación en el laboratorio, la reducción de la contaminación y los procedimientos de desinfección, así como recomendaciones para utilizar el tipo correcto de agua. Todo ello con el objetivo de ayudar a garantizar unos resultados experimentales de calidad que impulsen su descubrimiento.8,9
Si está cultivando sus células HEK 293 de producción de lentivirales en suspensión, puede beneficiarse del uso de un agitador orbital resistente al CO2 de tamaño reducido. Ideales para su uso en una incubadora de CO2, estos agitadores tienen componentes mecánicos especialmente tratados y diseñados para soportar hasta un 20% de CO2 y un 95% de humedad. En comparación, la mayoría de los agitadores orbitales al aire libre no están diseñados para soportar las condiciones ácidas de una cámara de CO2 y se deben sustituir periódicamente. Los agitadores orbitales resistentes al CO2 de Thermo Scientific™ también están diseñados para disipar un calor mínimo con el fin de garantizar que las condiciones dentro de la cámara de incubación de CO2 no se vean afectadas. La elección correcta del agitador orbital para su aplicación puede prolongar su vida útil, así como garantizar que se mantengan unas condiciones de crecimiento óptimas y la reproducibilidad en los resultados del cultivo.
Conclusiones
Hay muchos ejemplos de equipos de laboratorio presentes en la investigación de terapia génica en los que puede que no piense, pero que tienen un potencial significativo para impactar en la reproducibilidad de sus resultados experimentales. La lección crítica a tener en cuenta es prestar más atención y dedicar más tiempo a familiarizarse con las recomendaciones de los proveedores, tal y como se proporcionan en los manuales de usuario y en las variadas notas técnicas. En los entornos de investigación experimental es habitual centrarse principalmente en protocolos experimentales específicos, desestimando las recomendaciones específicas para la instalación y el posicionamiento adecuado de los equipos, así como el cuidado y el mantenimiento preventivo, la prevención de la contaminación y la limpieza y desinfección. Recuerde que incluso los equipos de laboratorio como cabinas de bioseguridad, centrífugas, incubadoras, agitadores, frigoríficos y congeladores deben tratarse con respeto y mucho cuidado. Es necesario que se conviertan en un compañero de viaje para que sus experimentos tengan más éxito y sean más reproducibles.
Referencias
1 Thermo Scientific. Smart Note: Orbital Shakers-¿Qué características son consideraciones importantes al evaluar un agitador orbital grande para la producción de ADN plasmídico que codifica vectores virales, para aplicaciones que incluyen CAR-T, terapia génica u otra ingeniería genética? https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LPD/Product-Information/Orbital-Shakers-DNA-Encoding-SmartNote-SNORBSHAKERDNA-EN.pdf
2 Thermo Scientific. Nota de aplicación: Elección del agitador orbital adecuado para su aplicación. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D20064.pdf
3 Thermo Scientific. Nota de aplicación: Orbital Shaker Benchmarks-Best Practices for Use and Maintenance. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/Orbital-Shaker-Benchmarks-Best-Practices-App-Note-ANMAXQBEST.pdf
4 Thermo Scientific. Application Note: Optimization of Plasmid DNA Production in Escherichia coli Utilizing the Thermo Scientific MaxQ 8000 Incubated Stackable Shakers. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D19993~.pdf
5 Thermo Scientific. Application Note: DNA Preparation Using the Thermo Scientific Sorvall LYNX Superspeed Centrifuge Series. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D21231.pdf
6 Thermo Scientific. Manual de instrucciones: Centrífuga de supervelocidad Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000/6000. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLED%2Fmanuals%2F50136519-h-Thermo%20Scientific%20Sorvall%20LYNX-en.pdf
7 Thermo Scientific. Software Centri-Log Plus: Una solución de gestión de datos precisa y fiable. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLPD%2Fbrochures%2FCentriLog-Plus-Brochure-GLOBAL-FNL-FWR-1.pdf
8 Thermo Scientific. Technical Note: Proper Care and Maintenance for a Cell Culture Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Warranties/TNCO2CAREFEED-EN.pdf
9 Thermo Scientific. Smart Note: CO2 Incubators-Smart Water for Your CO2 Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/brochures/CO2-Incubator-Water-SmartNote-EN.pdf
