Reactivos y kits de purificación de proteínas

La purificación de proteínas se puede lograr mediante varios métodos, cada uno explotando diferentes propiedades de las proteínas. Aquí hay cinco métodos comunes:

1. Cromatografía de afinidad
   Utiliza interacciones específicas entre la proteína de interés y un ligando unido a una resina de cromatografía. Proteínas etiquetadas con His se unen a la resina Ni-NTA, interacciones anticuerpo-antígeno. Las ventajas de este método son alta especificidad y rendimiento, a menudo resultando en alta pureza.

2. Cromatografía de intercambio iónico
   Separa las proteínas según su carga. Las proteínas se unen a la resina cargada y se eluyen cambiando la concentración de sal o el pH. Ejemplo: resinas DEAE (intercambiador de aniones) y CM (intercambiador de cationes). Las ventajas de este método son que es bueno para separar proteínas con diferentes puntos isoeléctricos (pI).

3. Cromatografía de exclusión por tamaño (filtración en gel)
   Separa las proteínas según su tamaño. Las proteínas más grandes eluyen primero ya que no entran en los poros de la resina, mientras que las proteínas más pequeñas eluyen más tarde. Ejemplo: resinas Sephadex, Superdex y Bio-Gel. Este método es útil para desalar e intercambiar tampones, así como para determinar el peso molecular.

4. Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
   Separa las proteínas según su hidrofobicidad. Las proteínas se unen a la resina hidrofóbica en condiciones de alta salinidad y se eluyen disminuyendo la concentración de sal. Ejemplo: resinas Phenyl-Sepharose y Octyl-Sepharose. Este método es efectivo para separar proteínas con diferentes grados de hidrofobicidad.

5. Electroforesis
   Separa las proteínas según su tamaño y carga aplicando un campo eléctrico. El SDS-PAGE se usa comúnmente para separar proteínas según su peso molecular. Ejemplo: SDS-PAGE (desnaturalizante), Native PAGE (no desnaturalizante) y IEF (enfoque isoeléctrico). Este método proporciona alta resolución y se utiliza ampliamente para fines analíticos para evaluar la pureza y el peso molecular.

Cada uno de estos métodos puede usarse individualmente o en combinación para lograr el nivel deseado de pureza y rendimiento para la proteína objetivo.

El EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) se utiliza comúnmente en la purificación de proteínas por varias razones:

• Agente quelante: El EDTA es un fuerte agente quelante que se une a iones metálicos como el calcio, el magnesio y el hierro. Al quelar estos iones, el EDTA evita que interfieran con el proceso de purificación de proteínas
• Inhibición de metaloproteasas: Muchas proteasas requieren iones metálicos para su actividad. El EDTA inhibe estas metaloproteasas al unirse a los iones metálicos, protegiendo así las proteínas objetivo de la degradación proteolítica durante la purificación
• Prevención de la agregación: Los iones metálicos a veces pueden causar la agregación de proteínas. Al eliminar estos iones, el EDTA ayuda a mantener la solubilidad y estabilidad de las proteínas
• Eliminación de proteínas contaminantes: Algunas proteínas contaminantes pueden unirse a iones metálicos y ser co-purificadas con la proteína objetivo. El EDTA puede ayudar a eliminar estos contaminantes al interrumpir sus interacciones dependientes de iones metálicos

En general, el EDTA se utiliza para mejorar el rendimiento y la pureza de la proteína objetivo al minimizar la degradación, agregación y contaminación.

Prevenir la agregación de proteínas durante la purificación es esencial para mantener la solubilidad y funcionalidad de las proteínas. Aquí hay estrategias específicas que puede implementar durante el proceso de purificación:

Optimizar las condiciones iniciales

• pH del tampón: Seleccione un pH de tampón que esté cerca del pH de máxima estabilidad de la proteína, generalmente ligeramente alejado de su punto isoeléctrico (pI)
• Fuerza iónica del tampón: Use concentraciones adecuadas de sales (por ejemplo, NaCl) para estabilizar la proteína y reducir las interacciones electrostáticas

Uso de aditivos

• Detergentes: Los detergentes no iónicos como Triton X-100, Tween-20 o CHAPS pueden ayudar a estabilizar las proteínas de membrana y prevenir la agregación
• Osmolitas: Los aditivos como glicerol (5-20%), sacarosa o trehalosa pueden estabilizar las proteínas mediante hidratación preferencial
• Agentes reductores: Incluya DTT (ditiotreitol) o β-mercaptoetanol para mantener los enlaces disulfuro en un estado reducido y prevenir la formación incorrecta de enlaces disulfuro
• Agentes quelantes: Use EDTA para quelar los iones metálicos divalentes que pueden promover la agregación o activar las proteasas

Inhibidores de proteasas

• Use un cóctel de inhibidores de proteasas (por ejemplo, PMSF, leupeptina, aprotinina) para prevenir la degradación proteolítica que puede llevar a la agregación

Control de temperatura

• Realice los pasos de purificación a 4°C para reducir la energía cinética y la propensión a la agregación de las proteínas. Use tampones refrigerados y mantenga las muestras en hielo

Manipulación suave

• Evite la mezcla vigorosa o el vortexado. Use pipeteo suave o agitación lenta para prevenir la desnaturalización mecánica. Minimice la exposición a las interfaces aire-líquido evitando la formación excesiva de espuma y usando tubos de baja adherencia

Concentración óptima de proteínas

• Mantenga las concentraciones de proteínas a niveles óptimos para minimizar la agregación. Las concentraciones altas pueden promover interacciones intermoleculares

Agentes estabilizantes

• Polioles: Los compuestos como PEG (polietilenglicol) pueden aumentar la solubilidad y prevenir la agregación
• Aminoácidos: La arginina (0.1-0.5 M) puede estabilizar las proteínas y prevenir la agregación

Condiciones de cromatografía

• Use condiciones de elución suaves (por ejemplo, elución con gradiente gradual) para evitar cambios bruscos en la composición del tampón. Evite usar altas concentraciones de imidazol u otros agentes de elución que puedan desestabilizar las proteínas

Almacenamiento adecuado

• Almacene las proteínas purificadas en pequeños alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
• Use crioprotectores como 10-50% de glicerol o sacarosa para proteger las proteínas durante la congelación

Uso de chaperonas moleculares

• Co-expresar chaperonas moleculares durante la expresión de proteínas recombinantes para ayudar en el plegamiento adecuado y prevenir la agregación