Buscamos nuevas vías para controlar la contaminación de cultivos celulares
Kris Wronski, científico de aplicaciones de cultivo celular de EMEA en Thermo Fisher Scientific, explica los peligros de la contaminación microbiana no deseada en laboratorios de cultivos celulares y cómo la contaminación puede tener repercusión directa en el crecimiento celular y la salud celular general.
Cómo puede repercutir la contaminación de los cultivos celulares en los resultados
La contaminación es un problema común en muchos laboratorios y en los laboratorios con cultivos celulares la contaminación microbiana es un contratiempo particular.
La mayoría de usuarios de laboratorios trabajan con ahínco para minimizar y reducir la contaminación de cultivos celulares aplicando medidas y protocolos especializados a fin de proteger las valiosas muestras y a sí mismos de cualquier daño. La contaminación no deseada de los cultivos celulares puede afectar a los atributos críticos de las células de mamíferos lo que, a su vez, puede repercutir significativamente en los resultados experimentales. Aunque es imposible eliminar todas las fuentes de contaminación de los cultivos celulares se pueden tomar medidas para reducirlas o evitar que se produzcan.
«Me centro en la contaminación microbiana, en la que microorganismos no deseados encuentran la forma de entrar en un cultivo celular de mamíferos lo que arruina el experimento al repercutir en los resultados experimentales. Por ejemplo, los virus son prácticamente imposibles de detectar cuando infectan un cultivo celular ya que no se perciben indicios visuales de su presencia. Además, no causan cambios en el pH en un medio de cultivo celular. Por lo tanto, es muy difícil identificar si hay una contaminación vírica», explica Wronski.
Esto significa que puede ser casi imposible para los usuarios de laboratorio identificar si un experimento se ha contaminado con un virus, lo que dificulta la gestión y el control de la contaminación vírica.
«La contaminación bacteriana y fúngica se encuentra entre las causas más comunes de contaminación y estos microorganismos proliferan rápidamente dentro de un medio de cultivo celular. Tiene sentido, ya que cualquier entorno que sea ideal para el crecimiento de cultivos celulares de mamíferos también lo es para el crecimiento de bacterias y hongos», aclara Wronski.
Afortunadamente, es mucho más fácil detectar la presencia de contaminación bacteriana o fúngica en cultivos celulares. Por ejemplo, algunas especies de moho se presentan en estructuras «en forma de grumos», que tienden a situarse en la parte superior de los cultivos de células de mamíferos. «La mayoría de las bacterias y hongos pueden empezar a causar la muerte de las células cultivadas con relativa rapidez porque hacen que el medio de cultivo sea más ácido y crecen más rápido que las células animales cultivadas mediante la absorción y la utilización de todos los nutrientes de un medio de cultivo y privando de nutrientes a las células valiosas», explica Wronski.
"En particular, el tipo más grave de contaminación de los cultivos celulares es la contaminación microbiana relacionada con los micoplasmas."
El micoplasma es un género de bacterias que puede ser patogénico tanto para animales como para seres humanos. Curiosamente, los micoplasmas carecen de pared celular alrededor de sus membranas y son los organismos autorreplicantes más pequeños que existen, con un diámetro aproximado de 0,1 µm. «Se trata de contaminantes muy extendidos en los cultivos celulares. Técnicamente los micoplasmas son bacterias, de lo que mucha gente no se da cuenta porque son mucho más pequeños que la mayoría de las bacterias, y como son pequeños pueden crecer sin medida en un cultivo sin que se perciban».
Este tipo de bacteria no provoca un cambio de pH en un medio de cultivo, lo que significa que muchos experimentos sufren contaminación por micoplasma sin que siquiera lo sepamos. «Lo que es aún peor cuando se trata de contaminación por micoplasma es que no tienen pared celular y esto provoca resistencia a la mayoría de los antibióticos». Además, su pequeño tamaño les puede permitir en algunas ocasiones escaparse de los filtros de esterilización. «Más allá de los signos básicos de crecimiento lento y corte transversal deficiente, los micoplasmas pueden afectar al metabolismo y la morfología de las células. Pueden provocar alteraciones cromosómicas e incluso dañar los ácidos nucleicos», aclara Wronski. Por lo tanto, no es de extrañar que la contaminación de los cultivos celulares pueda afectar significativamente a los resultados experimentales, lo que constituye un problema constante para muchos laboratorios de investigación y laboratorios comerciales que desarrollan nuevos tratamientos y productos utilizando procesos de cultivo celular.
Introducción de la contaminación en el laboratorio
Existen numerosas vías por las que la contaminación puede entrar en el laboratorio: los propios técnicos, una técnica de laboratorio deficiente, botellas agrietadas y herramientas de laboratorio contaminadas. «Yo dividiría los factores responsables de la contaminación que entra en el laboratorio en cuatro categorías: consumibles y reactivos, equipo general de laboratorio, factores ambientales y técnica aséptica».
Es sorprendente que Wronski mencione que el almacenamiento incorrecto de los reactivos contribuye en gran medida a la contaminación de los cultivos celulares. «La pregunta que hay que hacerse es si todos los reactivos de un medio se almacenan a la temperatura correcta. Un almacenamiento incorrecto puede favorecer a que aparezca la contaminación». En cuanto a la contaminación que se introduce a través de los equipos de laboratorio, Wronski aclara: «La contaminación introducida por los equipos de laboratorio se produce cuando no se han validado exhaustivamente y establecido procedimientos operativos estándar para mantener, limpiar y desinfectar los equipos lo que puede favorecer aún más la contaminación». Los factores ambientales son otra razón por la que puede producirse la contaminación, entre los que se incluyen las personas que trabajan en el laboratorio, junto con un aire acondicionado inadecuado. «Como seres humanos vivos, necesitamos microbios simbióticos en nuestra piel para funcionar correctamente, pero también podemos ser un vector portador de microbios no deseados altamente patógenos. Podemos llevarnos algunas esporas de cultivo al laboratorio en la ropa o incluso en la suela de los zapatos».
Asimismo, también es importante tener en cuenta la época del año cuando se piensa en la contaminación de los cultivos celulares, en particular la contaminación fúngica. «Algunas personas tienen diferentes tipos de alergias y problemas respiratorios asociados a las esporas que producen los hongos, y los hongos que producen esas esporas flotan en el aire. En cuanto al moho, puede crecer en casi cualquier lugar cuando haya humedad alrededor». Wronski continúa: «Hay periodos de máxima presencia de diferentes esporas fúngicas en el aire en diferentes épocas del año, o en diferentes regiones geográficas. En Europa, el pico de esporas fúngicas en el aire suele situarse entre finales de junio y agosto, con algunos días álgidos en septiembre. Pero dicho esto, durante todo el año podemos introducir las esporas de hongos, o lo puede hacer el sistema de aire acondicionado utilizado en los laboratorios de cultivos celulares». Para gestionarlo mejor, Wronski afirmó que los responsables de laboratorio y los técnicos deben establecer evaluaciones de riesgos y mecanismos de prevención adecuados.
Evaluación del riesgo de contaminación de cultivos celulares
Hay muchas formas de evaluar el riesgo de contaminación de cultivos celulares. Sin embargo, cada laboratorio es distinto y optará por abordar la contaminación de manera diferente. Wronski explica que «normalmente, para aplicar los procedimientos adecuados, es necesario desarrollar una estrategia basada en los riesgos. Es necesario definir paso a paso los procedimientos de investigación para determinar en consecuencia las posibles causas de la contaminación. Es muy importante marcar una línea de investigación muy sistemática». Por este motivo, es vital que los usuarios de laboratorio vuelvan sobre todos los pasos dados en el laboratorio con el fin de acotar la posible causa de la contaminación. Por ejemplo, el equipo de laboratorio, la técnica aséptica y la forma de manipular los consumibles y reactivos pueden influir en el crecimiento y desarrollo de las células en un cultivo.
Wronski indica que «es crucial investigar cómo se usa a diario cada pieza del equipo en la cadena de investigación. ¿Todos los miembros del laboratorio utilizan el equipo exactamente del mismo modo? El equipo que se debe tener en cuenta puede incluir congeladores, incubadoras de CO2, centrífugas, tanques de nitrógeno líquido y pipetas. Por ejemplo, si las pipetas no se desinfectan correctamente y no se efectúa un mantenimiento regular también pueden contribuir al problema propagando aún más la contaminación. Además, si no se mantienen los baños de agua de manera adecuada también pueden ser una gran fuente de contaminación».
En el caso de las incubadoras de CO2, si se colocan con las puertas de la incubadora orientadas hacia las puertas principales del laboratorio, o hacia las rejillas de ventilación del aire acondicionado, cada vez que un usuario del laboratorio abra la puerta de la incubadora las corrientes de aire que transportan polvo con microbios pueden entrar en la cámara de la incubadora, lo que aumenta el riesgo de contaminación de los cultivos celulares y pone en peligro experimentos valiosos.
Replantearse su equipo de laboratorio
Es posible que muchos científicos no sepan que el tipo de equipo de laboratorio que utilizan puede repercutir directamente en el crecimiento y la salud de las células. «Las características de diseño y rendimiento de las especificaciones de los equipos pueden tener un impacto directo en el crecimiento y la viabilidad de las células, e incluso los equipos generales de laboratorio como centrífugas, cabinas de bioseguridad e incubadoras de CO2 lo pueden tener», explica Wronski. Por ejemplo, cuando se tienen en cuenta las incubadoras de CO2, todos sus parámetros asociados repercutirán en la salud de las células, como la temperatura, la gasificación de CO2 y la humedad. La incubadora debe ser capaz de imitar las condiciones del organismo del que proceden las células, especialmente cuando se utilizan células primarias. «Las incubadoras de CO2 deben proporcionar un entorno uniforme, ya que las células responden a cambios realmente pequeños en el entorno», dice Wronski. Por lo tanto, una variación en la incubadora significa una variabilidad incontrolada en las células y, en consecuencia, resultados experimentales inexactos. «En la actualidad, las incubadoras de CO2 incorporan numerosas funciones innovadoras que garantizan la uniformidad de estos parámetros».
También es importante para los usuarios tener en cuenta el tipo de sensores usados con la incubadora de CO2, además del depósito de agua integrado, protegido y de gran capacidad. «Otra característica a tener en cuenta son los sensores de alta calidad, como los de infrarrojos, que están diseñados para controlar y reflejar con precisión el nivel de CO2». Wronski prosigue: «Solía trabajar con incubadoras de CO2 con una simple bandeja de agua, que simplemente se deslizaba dentro de la incubadora, pero siempre era propensa a la contaminación porque el agua estaba expuesta al aire. En la actualidad, existen depósitos de agua protegidos en el mercado y, cuando se utilizan en combinación con un sistema de flujo de aire, se puede crear un entorno uniforme para que las células proliferen y, al mismo tiempo, se protege el trabajo de la contaminación. Ahora se pueden incorporar distintas tecnologías para facilitar las cosas y mantener sanas las células», explica Wronski.
Todos los factores que ha descrito Wronski pueden contribuir a una rápida recuperación de todos los parámetros críticos para ayudar a mantener una excelente uniformidad, especialmente cuando se requieren condiciones hipóxicas. «Sin una suave corriente de aire activa en la cámara no es posible distribuir por igual los distintos gases en la cámara. En consecuencia, las células situadas en un estante diferente no reciben las mismas cantidades de oxígeno o CO2. Esto puede ser perjudicial para las células sensibles y para lograr resultados reproducibles».
¿Es fácil limpiar su equipo?
Por simple que parezca, es importante tener en cuenta si el material de laboratorio es fácil de desinfectar y limpiar con regularidad. «Debe asegurarse de que su equipo sea compatible con los distintos tipos de agentes y desinfectantes que piensa utilizar para evitar que se produzca la contaminación. Por ejemplo, algunas incubadoras de CO2 pueden ser 100% de cobre puro, como la incubadora de CO2 Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS™. Hay muchas investigaciones publicadas sobre el cobre y sus propiedades antimicrobianas», dice Wronski. «Aquí hay que tener cuidado porque muchos fabricantes utilizan eslóganes de marketing ingeniosos en los que dicen incorporar porcentajes más bajos de cobre en las aleaciones y esto puede disminuir realmente el efecto antimicrobiano. Animo a los lectores a que investiguen por su cuenta para evaluar cada una de estas características. Esto puede simplificar muchos procesos dentro del laboratorio y, en lo que respecta a los procedimientos de limpieza, puede reducir la frecuencia de limpieza que tendrá que incorporar a las operaciones diarias».
En cuanto a las incubadoras de CO2 y los ciclos de esterilización, existen métodos probados y validados para reducir la contaminación de los cultivos celulares: «Recomiendo buscar evidencias de pruebas y validación de los ciclos de esterilización según las normas de farmacopea más recientes. Si se mira con más detenimiento, no todos los fabricantes prueban o validan estas características de forma exhaustiva de acuerdo con los requisitos de la X edición de la Farmacopea de la UE. Muchos fabricantes no validan los ciclos de forma exhaustiva y no proporcionan datos suficientes con todos los controles positivos y negativos requeridos y el uso de indicadores biológicos correctos cuando realizan esas validaciones. Por lo tanto, es vital que los científicos que utilizan estas incubadoras realicen sus investigaciones para proteger los valiosos cultivos celulares», explica el experto.
Es importante no olvidar tampoco los equipos críticos, utilizados en casi todos los laboratorios para el procesamiento de células, como las centrífugas. Las centrífugas, como la Scientific™ Sorvall™ X4 Pro Centrifuge, incluyen ahora la tecnología de intercambio rápido del rotor que ayuda a los usuarios a desinfectar rápidamente el equipo con más facilidad que antes. «Recuerdo que en el pasado, al tratar con centrífugas, no podía desmontar el rotor con rapidez después de cada centrifugado y no podía desinfectar eficazmente la cámara de centrifugado. Ahora se puede hacer mucho más rápido». Por lo que respecta a las cabinas de bioseguridad, Wronski explica que «algunas cabinas de bioseguridad, como la Thermo Scientific™ Herasafe™ 2030i CTS serie BSC, incorporan diversas funciones como la posibilidad de abrir por completo la ventana delantera con bisagras. Esto le permite limpiar y desinfectar en su totalidad cada parte de la cabina de forma rápida y eficaz. Algunos fabricantes piensan ahora en cómo hacer las cosas más sencillas y facilitarnos la vida».
Ayuda a la proliferación de las células
Wronski afirma: «En la actualidad, el cultivo celular se está alejando del uso de líneas celulares establecidas que los laboratorios cultivan durante muchos años. Para que los investigadores generen datos experimentales más precisos y exactos, hay que pasar de esas líneas celulares a lo que llamamos células primarias que proceden directamente del cuerpo humano». Se reconoce que estas células son muy frágiles y complejas de manejar, pero también imitan mejor las condiciones del organismo y, por tanto, ofrecen una mejor representación del cuerpo humano. «Las concentraciones de oxígeno en el interior del cuerpo humano o animal son en realidad muy inferiores a las del aire que respiramos. El oxígeno de la atmósfera constituye el 20% del aire, pero en nuestros tejidos la concentración varía en función de la proximidad de las células a los pulmones o a la sangre arterial. Así pues, los microambientes de esas células primarias dependen de dónde se encuentren dentro de nuestro cuerpo», explica Wronski. «Por lo tanto, el cultivo de células con poco oxígeno puede imitar mejor las condiciones internas del organismo, especialmente cuando se utilizan células primarias. Por eso nacieron las incubadoras trigás, que pueden crear la atmósfera artificial cuando se trata de manipular la concentración de oxígeno con la ayuda del gas nitrógeno».
No es de extrañar que la contaminación pueda dañar muchas células y experimentos valiosos y que pueda paralizar experimentos enteros. Todo ello puede generar pérdidas económicas significativas para los laboratorios. Wronski concluye así: «Tendrá que descartar sus células a la hora de investigar. Tendrá que empezar de nuevo. Esto puede resultar muy caro, lo que supone un reto para los laboratorios académicos que no disponen de mucho dinero de subvenciones». Por lo tanto, es crucial que los laboratorios tomen las medidas adecuadas para reducir la contaminación de los cultivos celulares con el fin de proteger las valiosas muestras y su dinero. Afortunadamente, los usuarios de laboratorio pueden minimizar el riesgo de contaminación de los cultivos celulares de muchas formas como ya ha señalado Wronski, quien anima a los científicos a que investiguen a fondo y estudien qué equipos y protocolos de laboratorio emplear para generar resultados de gran precisión y libres de contaminación.
