¿Sabe qué es la PCR?
Todos hemos oído hablar mucho últimamente de la PCR, ya que esta técnica de análisis ha estado en el punto de mira por su necesidad en las pruebas de diagnóstico de COVID-19. Ahora, muchos de nosotros pronunciamos este término, reservado principalmente a los científicos (en concreto a los biólogos) como si todos supiéramos exactamente lo que es. Pero, ¿qué es realmente la PCR? PCR son las siglas en inglés de Reacción en Cadena de la Polimerasa, una técnica de laboratorio que se utiliza para copiar rápidamente un segmento de ADN. Esta técnica permite a los científicos tomar un fragmento muy pequeño de secuencias de ADN y amplificarlo hasta obtener una cantidad lo suficientemente grande como para poder estudiarlo en detalle en un segundo paso.
Para las pruebas de diagnóstico de COVID-19, la técnica utilizada es la RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa mediante Transcripción Inversa): se añaden sustancias conocidas como Transcriptasa Inversa o ADN polimerasa a una muestra nasofaríngea. Los coronavirus tienen un genoma de ARN no segmentado. La Transcriptasa Inversa es necesaria para transcribir el ARN viral en ADNc (ADN complementario). El ADNc puede utilizarse posteriormente como material de partida en una PCR para amplificar secuencias específicas a partir de él utilizando la ADN polimerasa. Los cebadores y las sondas diseñados específicamente se unen a las secuencias de ADNc para señalar que se ha encontrado un patógeno.
Esta técnica se utiliza para el diagnóstico médico rápido de enfermedades como el COVID-19, así como de la tuberculosis y otras infecciones, y también ha pasado a ser habitual en la investigación biomédica y criminalística. Sin embargo, no existe un único método de PCR. A continuación, se expone una tabla donde se explican las principales ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos.
PCR en tiempo real frente a PCR tradicional frente a PCR digital de un vistazo
| PCR digital | PCR en tiempo real | PCR tradicional | |
|---|---|---|---|
| Descripción general | Mide la fracción de réplicas negativas para determinar las copias absolutas. | Mide la amplificación de PCR conforme se produce. | Mide la cantidad de producto de PCR acumulado al final de los ciclos de PCR. |
| ¿Cuantitativa? | Sí, la fracción de reacciones de PCR negativas se ajusta a un algoritmo estadístico de Poisson | Sí, porque los datos se recopilan durante la fase (logarítmica) de crecimiento exponencial de PCR cuando la cantidad de producto de PCR es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico de la plantilla. | No, aunque la comparación de la intensidad de la banda amplificada en un gel según los patrones de una concentración conocida puede ofrecer resultados «semicuantitativos». |
| Aplicaciones |
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| Amplificación de ADN para:
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| Resumen | Advantages of digital PCR:
| Ventajas de la PCR en tiempo real:
| Desventajas de la PCR tradicional:
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Para comprender por qué la PCR tradicional tiene tantas limitaciones, es importante comprender lo que ocurre durante una reacción de PCR. Un ciclo de PCR básico se puede dividir en tres fases:
- Exponencial
Se acumula una duplicación exacta del producto en cada ciclo (suponiendo que la eficacia de la reacción sea del 100 %). La reacción es muy específica y precisa. La amplificación exponencial se produce porque todos los reactivos son nuevos y están disponibles, y la cinética de la reacción obliga a esta a favorecer la duplicación del amplicón.
- Lineal (alta variabilidad)
Conforme avanza la reacción, algunos de los reactivos se consumen como resultado de la amplificación. Las reacciones empiezan a perder velocidad y el producto de PCR deja de duplicarse en cada ciclo.
- Meseta (punto final: detección de gel para métodos tradicionales)
La reacción se ha detenido, no se generan más productos y, si se deja demasiado tiempo, los productos de PCR comenzarán a degradarse. Cada tubo o reacción formará la meseta en un punto diferente, debido a la diferente cinética de reacción de cada muestra. Estas diferencias se pueden apreciar en la fase de meseta. La fase de meseta es donde la PCR tradicional realiza sus mediciones, también conocida como detección de punto final.
Figura 1: Fases de PCR.
La PCR tradicional realiza mediciones en la meseta, lo que le ofrece resultados variables
En la figura 2, tres muestras replicadas, que tenían la misma cantidad de ADN al comienzo de la reacción, tienen diferentes cantidades de producto de PCR en la fase de meseta de la reacción (debido a variaciones en la cinética de reacción). Por lo tanto, resultará más preciso tomar mediciones durante la fase exponencial, donde las muestras replicadas se amplifican exponencialmente.
Figura 2: Muestras idénticas producen diferentes cantidades de producto de reacción en la fase de meseta de la PCR.
La PCR en tiempo real realiza mediciones en la fase exponencial para una cuantificación más exacta
La PCR en tiempo real se centra en la fase exponencial, porque proporciona los datos más precisos y exactos para la cuantificación. Dentro de la fase exponencial, el instrumento de PCR en tiempo real calcula dos valores. La línea de umbral es el nivel de detección en el que una reacción alcanza una intensidad de fluorescencia por encima del fondo. El ciclo de PCR en el que la muestra alcanza este nivel se denomina el umbral de ciclo (Ct). El valor de Ct se utiliza en la cuantificación posterior o la detección de presencia/ausencia. Al comparar los valores de Ct de muestras de concentración desconocida con una serie de patrones, se puede determinar de manera exacta la cantidad de ADN de plantilla en una reacción desconocida.
Figura 3: El ciclo de PCR en el que la muestra alcanza una intensidad de fluorescencia por encima del fondo es el umbral de ciclo (Ct).
La PCR digital cuenta las moléculas individuales para una cuantificación absoluta
La PCR digital funciona mediante la partición de una muestra en muchas reacciones de PCR individuales en tiempo real; algunas partes de estas reacciones contienen la molécula objetivo (positivo), mientras que otras no (negativo). Tras el análisis de PCR, la fracción de respuestas negativas se usa para generar una respuesta absoluta del número exacto de moléculas objetivo de la muestra, sin hacer referencia a patrones o controles endógenos.
Figura 4: La PCR digital utiliza la relación de reacciones de PCR positivas (negro) a negativas (blanco) para contar el número de moléculas objetivo.
