Procesamiento posterior de células T primarias mediante centrífugas Thermo Scientific™ General-Purpose Pro
Introducción
El lavado y la concentración de células es uno de los pasos principales en la investigación y fabricación de terapias celulares. Durante este paso, los cultivos celulares expandidos se concentran y se lavan en soluciones tampón adecuadas para prepararlos para los pasos posteriores, como el llenado y la formulación. Durante muchos años, el método principal ha sido la centrifugación por lotes, aunque a lo largo de los años han surgido métodos alternativos como la centrifugación de flujo continuo, la separación basada en acústica y la filtración de flujo tangencial.
Aquí mostramos las ventajas de la centrifugación por lotes así como soluciones innovadoras utilizando centrífugas Thermo Scientific™ General-Purpose Pro que se pueden optimizar para el procesamiento posterior de células T primarias. También compartimos algunos resultados ejemplares de viabilidad y recuperación de células T tras el lavado y la concentración.
Características de los equipos adecuados para aplicaciones de fabricación de terapia celular
Control total y seguro: SECURE-Spin
Las centrífugas ofrecen un avanzado sistema de gestión de usuarios en modo SECURE-Spin, mediante el cual se asignan a los usuarios diferentes funciones y privilegios para mantener un control seguro, una característica que respalda el cumplimiento de la norma FDA 21 CFR Parte 11 (figura 1). Las funciones avanzadas del modo SECURE-Spin permiten:
- Registrar hasta 120 individuos con nombres de usuario y contraseñas exclusivos.
- Asignar privilegios y funciones individuales a cada usuario, con diferentes autoridades.
- Realizar un seguimiento de todos los cambios realizados por los usuarios en programas o configuraciones con un registro de auditoría.
Reproducibilidad: La función integradora ACE
La Función Integradora Thermo Scientific™ Accumulated Centrifugal Effect™ (ACE™) es un modelo matemático que ayuda a transferir aplicaciones y ajustes de parámetros entre centrífugas modificando automáticamente la duración de la ejecución como sustituto del tiempo (figura 2).
La función ACE puede activarse navegando a "Ajustes" y luego a "Controles" antes de cambiar el modo de consigna a "Avanzado". Se ha diseñado para ayudar a garantizar que diferentes lotes de muestra reciban el mismo efecto centrífugo deseado, independientemente del peso de la muestra, la antigüedad del equipo o factores ambientales como la altitud (figura 3). Los beneficios de la activación de funciones para las centrífugas Pro de uso general incluyen:
- Ayuda a permitir la misma fuerza centrífuga total acumulada independientemente de las condiciones (por ejemplo, tiempo de funcionamiento, carga del rotor y carga de la muestra).
- Ofrece rendimientos reproducibles compensando automáticamente las variaciones en la aceleración mediante el ajuste del tiempo de funcionamiento de la centrífuga.
- Apoya la reproducibilidad vital en la terapia celular y genética.
Para determinar el valor ACE, se necesita un protocolo de trabajo en el que se conozcan la velocidad y el tiempo de ejecución. En el modo ACE, introduzca el valor óptimo de velocidad y un valor ACE "alto" (el valor más alto es para asegurar que la carrera no se detiene prematuramente). Inicie un cronómetro al comienzo del ciclo de centrifugación, detenga la centrífuga cuando el tiempo en el cronómetro haya alcanzado el tiempo de ejecución conocido y registre el valor ACE que se muestra en la pantalla.
Prevención de la contaminación
Las tapas de biocontención ClickSeal™ de Thermo Scientific™ protegen las muestras para que no se contaminen entre sí, lo que permite centrifugar varias muestras en el mismo ciclo. En caso de cualquier evento de derrame, la muestra queda contenida dentro de su cubo protegiendo así las muestras de otros cubos, a los usuarios y al entorno del laboratorio. Las principales características de las tapas ClickSeal son:
- Diseño ergonómico para facilitar la apertura y el cierre con una sola mano, ya sea zurda o diestra.
- Opciones de sellado de biocontención para un uso sin guantes.
- Sencillo manejo para todos los usuarios de laboratorio, con la eliminación de los tapones de rosca de varias vueltas y los complicados clips de alta presión.
- Certificación de biocontención por el Instituto Nacional de Protección de la Salud, Porton Down, Reino Unido.
El estado de salud en la investigación y fabricación de terapias celulares, en particular para los tipos de células autólogas, no está disponible fácilmente y la rapidez es clave para el éxito. Por ello, los equipos de laboratorio deben estar preparados para funcionar a la perfección cuando se necesiten. El botón "Estado de salud" de nuestras centrífugas realiza un seguimiento y registra cada alarma, notificación de alerta y ciclo de vida del rotor (figura 4). De este modo, se evitan tiempos de inactividad lo que es vital para la continuidad del proceso.
Gestión del rotor: SMART-Spin™
El sistema avanzado de gestión del rotor SMART-Spin™ maximiza la aceleración, la desaceleración y el desequilibrio de carga residual para cada opción de rotor y cangilón. Las centrífugas Pro de uso general permiten además el ajuste fino de los parámetros de centrifugación con alta precisión (incrementos de 1rpm para la velocidad y 1s para el tiempo). Además, los suaves comportamientos de aceleración y desaceleración ayudan a maximizar la integridad de los gránulos a la vez que mantienen la eficiencia del proceso. En el ejemplo siguiente, empleamos el perfil de aceleración 9 y el perfil de desaceleración 7 para minimizar la pérdida de células y mantener la viabilidad.
Viabilidad y recuperación de células T
Métodos
Las células T primarias proporcionadas por donantes sanos se transfirieron a recipientes cónicos de 50mL y 500mL a una concentración de 1 x 106 células/mL. El recuento de células se realizó utilizando el dispositivo Via2-Cassette™ y el instrumento NucleoCounter™ NC-200™ (ChemoMetec; Allerod, Dinamarca). Los contenedores se centrifugaron en la Thermo Scientific™ Multifuge™ X4R Pro General-Purpose Centrifuge a 400 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se determinaron la viabilidad y la recuperación de las células T tras el lavado y la concentración.
Nota: La concentración celular de 1 x 10⁶ células/mL utilizada es de cuatro a cinco veces inferior a los valores habituales con el fin de simular el peor de los casos.
Resultados
Nuestros resultados sugieren que ambos tipos de recipientes cónicos, 50mL y 500mL, rindieron de forma equivalente en la concentración de células T con una disminución mínima de la viabilidad y altas tasas de recuperación (figura 5).
Conclusiones
La centrifugación por lotes ha sido el caballo de batalla de la fabricación de terapia celular durante décadas. Basándonos en nuestros hallazgos, concluimos que es el método preferido debido a las siguientes ventajas:
- No hay limitaciones en cuanto a los tipos de células aplicables.
- Sin atascos cuando se procesan densidades celulares elevadas.
- Alto rendimiento con baja densidad de células.
- Control activo y mantenimiento de la temperatura del proceso.
- Baja inversión de capital, con bajo coste de mantenimiento y funcionamiento.
- Desarrollo de procesos sin complicaciones.
- Suficientemente flexible para ser utilizado en numerosas aplicaciones de laboratorio.
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