Invitrogen™ Thiol Fluorescent Detection Kit

El kit de detección de tiol de proteínas (para uso exclusivo en investigación) es un ensayo fluorescente y está diseñado para la detección y cuantificación de tiol de proteínas en tampones biológicos comunes, incluidos tampones biológicos que contienen Tris, fosfato y citrato.

Este kit completo y listo para usar incluye placas negras de 96 pocillos, patrón de N-acetilcisteína, reactivo de detección, tampón de ensayo y otros componentes para realizar el ensayo. Para utilizar este kit se requiere un lector de microplacas de 96 pocillos capaz de leer emisiones fluorescentes a 510 nm, con excitación a 390 nm.

Características de rendimiento
• Tipo de ensayo: kit de detección fluorescente
• Tipos de muestras: tampones biológicos comunes, incluidos tampones con Tris, fosfato y citrato
• Sensibilidad: 4,62 nm
• Intervalo de curva estándar: 78–10 000 nM
• Reactividad: independiente de la especie

Antecedentes
Los tioles libres en los sistemas biológicos desempeñan un papel importante. Los grupos de tioles de residuos de cisteína modificados oxidativamente modulan la actividad de un gran número de proteínas. Uno de los problemas más acuciantes de este enfoque es determinar con precisión el grado de modificación de los aminoácidos específicos (como los residuos de cisteína) en una muestra de proteínas complejas, especialmente en presencia de agentes caotrópicos como el clorhidrato de guanina.

Este kit de detección fluorescente de tiol permite al usuario determinar con precisión el contenido de tiol libre en las muestras mediante un reactivo de detección no fluorescente patentado, que se convierte en un producto fluorescente brillante tras la reacción con el tiol de la muestra. El tiol de la muestra puede ser el que se genera mediante una reacción, como el producto final de una reacción enzimática (por ejemplo, el glutatión), o puede ser el contenido de cisteína de la proteína que va a medirse. Este ensayo se ha probado en muestras con concentraciones de hidrocloruro de guanidina de hasta 2 M en el tampón de ensayo que se incluye con el kit. Esto permite determinar con precisión el contenido de tiol de las proteínas desplegadas. Aunque se proporciona un derivado de cisteína como estándar que puede utilizarse para cuantificar las cisteínas libres en péptidos y proteínas, el ensayo debe calibrarse a un estándar lo más cercano posible, en términos químicos, al tiol que se esté midiendo. Por ejemplo, si el usuario final utiliza el kit para medir el glutatión, el ensayo debe calibrarse a una preparación estándar de glutatión conocida y validada.

Principio del ensayo
El kit de detección fluorescente de tiol protéico está diseñado para medir cuantitativamente los grupos de tiol generados o presentes en muestras biológicas. Se proporciona un estándar para generar una curva estándar para el ensayo y todas las muestras deben leerse de la curva generada. Las muestras y los patrones se pipetean en una placa negra microtituladora. Una vez que la muestra o el estándar se mezclan con el reactivo de detección y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos, el producto fluorescente se lee a 510 nm en un lector de placas fluorescentes con excitación a 390 nm. Dado que los tioles libres generados biológicamente, como el glutatión y los grupos de proteína tiol, existen en diferentes entornos, la cantidad de tiol presente o generado debe calibrarse utilizando un patrón adecuado.