Thermo Scientific™ Pierce™ Kinase Enrichment Kit with ADP Probe

Las sondas ActivX Desthiobiotin-ATP o ADP son derivados de nucleótidos que modifican covalentemente el sitio activo de las enzimas en los residuos de lisina conservados en el sitio de unión de nucleótidos. La estructura de estas sondas consiste en una biotina modificada (destiobiotina) unida al nucleótido a través de un enlace de acilo-fosfato lábil. La destiobiotina es un análogo de la biotina que se une menos estrechamente a las proteínas de unión a biotina, lo que resulta en una unión que se invierte fácilmente por el desplazamiento de la biotina, el pH bajo o la desnaturalización de calor.

Las sondas de enriquecimiento del sitio activo ActivX son ventajosas para determinar los niveles de enzimas activas utilizando sondas etiquetadas con análogos para permitir el perfilado de enzimas activas e inactivas. Las sondas ActivX ATP y ADP para etiquetar de forma covalente el sitio activo de las ATPasas, incluidas las chaperonas y las enzimas metabólicas, para permitir su enriquecimiento selectivo mediante una etiqueta de destiobiotina.

Las sondas de destiobiotina ATP o ADP se pueden utilizar para enriquecer, identificar y perfilar de forma selectiva las clases de enzimas objetivo o evaluar la especificidad de los inhibidores de enzimas. Debido a que muchas ATPasas y otras proteínas de unión a nucleótidos se unen a nucleótidos o inhibidores incluso cuando están enzimáticamente inactivos, las sondas de destiobiotina permiten el perfilado de enzimas activas e inactivas en una muestra compleja. La preincubación de muestras con inhibidores de moléculas pequeñas que compiten por sitios activos puede usarse para determinar la afinidad de unión de inhibidores. Las sondas de nucleótidos del sitio activo también se pueden usar para identificar inhibidores fuera del objetivo. Con el enriquecimiento selectivo, se pueden identificar y perfilar las clases de enzimas objetivo en las muestras o se puede evaluar la especificidad y la afinidad de los inhibidores de enzimas.

Aplicaciones de sondas ActivX ATP y ADP:
• Perfilar las afinidades de unión de moléculas pequeñas y la inhibición del sitio activo de una forma dependiente de la dosis
• Identificar de decenas a cientos de inhibidores objetivo y no objetivo fuera de los tejidos, células y proteomas subcelulares
• Enriquecer las enzimas en base a la función

La evaluación del etiquetado de sitios activos con sondas de destiobioina puede realizarse mediante Western blot o espectrometría de masas (MS). Para el flujo de trabajo Western blot, las proteínas etiquetadas con destiobiotina se enriquecen para el análisis SDS-PAGE y la posterior detección con anticuerpos específicos. Para el flujo de trabajo de MS, las proteínas etiquetadas con destiobiotina se reducen, se alquilan y se digieren enzimáticamente a péptidos. Solo los péptidos de sitio activo etiquetados con destiobiotina se enriquecen para su análisis mediante LC-MS/MS. Ambos flujos de trabajo se pueden usar para determinar la unión del objetivo del inhibidor, pero solo el flujo de trabajo de MS puede identificar los objetivos globales del inhibidor y los objetivos secundarios.

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