Thermo Scientific™ Eco57I (AcuI) (5 U/μL)

5'...C T G A A G (N)₁₆▵...3'

3'...G A C T T C (N)₁₄▵...5'

Condiciones para una actividad del 100 %:

• [1 tampón G] + SAM:[10 mm de Tris-HCl (pH 7,5 a 37 °C), 10 mm de MgCl₂, 50 mm de NaCl y 0,1 mg/ml de BSA] + 0,01 mm de S-adenosilmetionina
• Incubar a 37 °C.

Tampón de almacenamiento:

• Eco57I se suministra en: 10 mM de fosfato de potasio (pH 7,4 a 25 °C), 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mm de DTT y 50 % de glicerol (v/v)

Ligadura y refragmentación:

• Tras una sobredigestión con 10 veces la cantidad de Eco57I, aproximadamente el 70 % de los fragmentos de ADN pueden ligarse, pero no se pueden recortar debido a la metilación de la secuencia de reconocimiento de esta enzima

Efectos de metilación:

• Dam: nunca se solapa, sin efecto.
• Dcm: nunca se solapa, sin efecto.
• CpG: nunca se solapa, sin efecto.
• EcoKI: nunca se solapa, sin efecto.
• EcoBI: puede solaparse, efecto sin determinar.

Nota:

Eco57I requiere solo Mg²⁺ para su actividad, pero se estimula por S-adenosilmetionina. Con 0,01 mm de S-adenosilmetionina se obtiene una actividad 100 veces mayor de Eco57I. Aún así, es difícil conseguir una fragmentación completa de algunos sustratos con Eco57I. La concentración de Eco57I viene determinada por el nivel máximo de fragmentación que se alcanza cuando no se observa ningún cambio en el patrón de fragmentación aunque se emplee más enzima. La concentración baja de sales, la concentración alta de glicerol (> 5 %), un pH >8 o un gran exceso de la enzima pueden producir actividad estrella (star activity). Eco57I puede permanecer asociada al ADN fragmentado. lo que puede provocar un desplazamiento de las bandas de ADN durante la electroforesis. Para evitar patrones atípicos de las bandas de ADN, use colorante de carga de ADN 6X y solución SDS para la preparación de muestras o caliente el ADN digerido en presencia de SDS antes de la electroforesis.