Thermo Scientific™ ActivX™ Desthiobiotin-FP Serine Hydrolase Probe

Las sondas ActivX™ FP presentan un grupo de fluorofosfonatos reactivos que, de forma específica y covalente, etiquetan la serina de sitio activo de las hidrolasas serina enzimáticamente activas. Estas sondas están disponibles con una etiqueta de destiobiotina (análogo de biotina) para el enriquecimiento selectivo o un grupo azido reactivo (reactivos de Staudinger) que facilitan el etiquetado multiplexado cuando se usan con etiquetas derivadas de fosfina o alquino.

Las sondas de enriquecimiento del sitio activo ActivX son ventajosas para determinar los niveles de enzimas activas utilizando sondas etiquetadas con análogos para permitir el perfilado de enzimas activas e inactivas. Las sondas ActivX enriquecen selectivamente solo a aquellas enzimas que son funcionalmente activas y biológicamente relevantes en el momento del etiquetado. Con el enriquecimiento selectivo, se pueden identificar y perfilar las clases de enzimas objetivo en las muestras o se puede evaluar la especificidad y la afinidad de los inhibidores de enzimas.

Aplicaciones de sondas ActivX FP:
• Determinar la actividad enzimática de la hidrolasa serina en células y lisados
• Establecer la serina de sitio activo de miembros de la familia de hidrolasas serina funcionalmente diversos (por ejemplo, proteasas, lipasas, esterasas)
• Detectar afinidades de unión de moléculas pequeñas e inhibición del sitio activo
• Detectar afinidades de unión de moléculas pequeñas e inhibición del sitio activo

La superfamilia de las serina hidrolasas es una de las familias de enzimas más grandes y diversas de los proteomas eucariotas. Las hidrolasas serinas generalmente se agrupan en dos grandes familias: proteasas serinas (por ejemplo, tripsina, elastasa y trombina) e hidrolasas serinas metabólicas. Las hidrolasas serinas metabólicas se dividen en múltiples subclases enzimáticas (por ejemplo, esterasas, lipasas, amidasas y peptidasas) basadas en la estructura, el mecanismo catalítico y la preferencia de sustrato. Estas sondas se pueden utilizar para evaluar la actividad o detectar inhibidores de moléculas pequeñas en enzimas derivadas de lisados celulares, fracciones subcelulares, tejidos y proteínas recombinantes.

La evaluación del etiquetado de sitios activos con sondas de destiobioina puede realizarse mediante Western blot o espectrometría de masas (MS). Para el flujo de trabajo Western blot, las proteínas etiquetadas con destiobiotina se enriquecen para el análisis SDS-PAGE y la posterior detección con anticuerpos específicos. Para el flujo de trabajo de MS, las proteínas etiquetadas con destiobiotina se reducen, se alquilan y se digieren enzimáticamente a péptidos. Solo los péptidos de sitio activo etiquetados con destiobiotina se enriquecen para su análisis mediante LC-MS/MS. Ambos flujos de trabajo se pueden usar para determinar la unión del objetivo del inhibidor, pero solo el flujo de trabajo de MS puede identificar los objetivos globales del inhibidor y los objetivos secundarios. La sonda Azido-FP se puede usar en combinación con una etiqueta derivada de fosfina o alquino para la detección o el enriquecimiento de serina hidrolasas mediante Western blot o espectrometría de masas.

Estos productos están sujetos a una licencia de uso limitado.