Procesamiento posterior de células T primarias utilizando centrífugas de uso general Thermo Scientific Pro
Introducción
El lavado y la concentración de células es uno de los pasos principales en la investigación y la fabricación de terapias celulares. Durante este paso, los cultivos celulares expandidos se concentran y se lavan en soluciones tampón adecuadas para prepararlos para las etapas posteriores, como el llenado y la formulación. El método principal durante muchos años ha sido la centrifugación por lotes, aunque con el tiempo han surgido métodos alternativos como la centrifugación de flujo continuo, la separación basada en acústica y la filtración por flujo tangencial.
Aquí mostramos las ventajas de la centrifugación por lotes, así como soluciones innovadoras utilizando las centrífugas Thermo Scientific™ General-Purpose Pro, que pueden optimizarse para el procesamiento posterior de células T primarias. También compartimos algunos resultados ejemplares sobre la viabilidad y recuperación de células T después del lavado y la concentración.
Características del equipo diseñado para aplicaciones de fabricación de terapias celulares
Control seguro y total: SECURE-SpinSecure and Total Control: SECURE-Spin
Las centrífugas proporcionan un sistema avanzado de gestión de usuarios en modo SECURE-Spin, mediante el cual se asignan a los usuarios diferentes roles y privilegios para mantener un control seguro, una función que respalda el cumplimiento de la norma FDA 21 CFR Parte 11 (figura 1). Las funciones avanzadas del modo SECURE-Spin permiten:
Registrar hasta 120 personas con nombres de usuario y contraseñas únicas.
Asignar privilegios y roles individuales a cada usuario, con diferentes niveles de autoridad.
Rastrear todos los cambios realizados por los usuarios en los programas o configuraciones mediante un registro de auditoría.
Figura 1: Ejemplo de los pasos del sistema avanzado de gestión de usuarios para “reactivar” un perfil de usuario avanzado.
Reproducibilidad: La función ACE Integrator
La función Thermo Scientific™ Accumulated Centrifugal Effect™ (ACE™) Integrator es un modelo matemático que ayuda a transferir aplicaciones y configuraciones de parámetros entre centrífugas modificando automáticamente la duración de la corrida como sustituto del tiempo (figura 2).
Figura 2: Beneficios de la función ACE Integrator. La función ACE ayuda a garantizar que todas las muestras experimenten el mismo efecto centrífugo total (el área bajo la curva velocidad/tiempo) al sumar o restar tiempo a una corrida.
La función ACE puede activarse navegando a “Configuración” y luego a “Controles”, antes de cambiar el modo de punto de ajuste a “Avanzado”. Ha sido diseñada para ayudar a garantizar que distintos lotes de muestras reciban el mismo efecto centrífugo deseado, independientemente del peso de la muestra, la antigüedad del equipo o factores ambientales como la altitud (figura 3). Los beneficios de la activación de esta función en las centrífugas General-Purpose Pro incluyen:
Ayuda a garantizar el mismo efecto centrífugo total acumulado sin importar las condiciones (p. ej., tiempo de corrida, carga del rotor y carga de la muestra).
Proporciona rendimientos reproducibles al compensar automáticamente las variaciones en la aceleración ajustando el tiempo de centrifugación.
Favorece la reproducibilidad esencial en las terapias celulares y génicas.
Figura 3: Configuración del valor de la función ACE Integrator.
Para determinar el valor ACE, se necesita un protocolo de trabajo en el que se conozcan la velocidad y el tiempo de corrida. En modo ACE, ingrese el valor de velocidad óptimo y un valor ACE “alto” (el valor alto evita que la corrida se detenga antes de tiempo). Inicie un cronómetro al comenzar la centrifugación, detenga la centrífuga cuando el cronómetro alcance el tiempo de corrida conocido y registre el valor ACE mostrado en la pantalla.
Prevención de la contaminación: ClickSeal™
Las tapas de biocontención Thermo Scientific™ ClickSeal™ protegen las muestras de contaminarse entre sí, lo que permite la centrifugación de diferentes muestras en la misma corrida. En caso de derrames, la muestra queda contenida dentro de su cubo, protegiendo así las muestras en otros cubos, a los usuarios y al entorno del laboratorio. Las características principales de las tapas ClickSeal incluyen:
Diseño ergonómico para abrir y cerrar fácilmente con una sola mano, tanto izquierda como derecha.
Opciones de sellado de biocontención compatibles con el uso con guantes.
Funcionamiento sencillo para todos los usuarios del laboratorio, eliminando las tapas roscadas de múltiples vueltas y los clips de alta presión complicados.
Certificación de biocontención por el National Institute for Health Protection, Porton Down, Reino Unido.
El estado de salud en la investigación y fabricación de terapias celulares, especialmente para tipos celulares autólogos, no suele estar disponible, y la rapidez es clave para el éxito. Por ello, el equipo de laboratorio debe estar listo para funcionar sin fallos cuando sea necesario. El botón “Estado de salud” de nuestras centrífugas rastrea y registra cada alarma, notificación de alerta y ciclo de vida del rotor (figura 4). Esto evita tiempos de inactividad, lo cual es vital para la continuidad del proceso.
Figura 4: La salud de la centrífuga y del rotor en detalle en la pantalla de Estado de salud.
Gestión de rotores: SMART-Spin™
El sistema avanzado de gestión de rotores SMART-Spin™ maximiza la aceleración, la desaceleración y el desequilibrio de carga residual para cada opción de rotor y cubo. Las centrífugas General-Purpose Pro permiten además un ajuste fino de los parámetros de centrifugación con alta precisión (incrementos de 1 rpm en velocidad y 1 s en tiempo). Asimismo, los comportamientos suaves de aceleración y desaceleración ayudan a maximizar la integridad del pellet sin comprometer la eficiencia del proceso. En el ejemplo siguiente, empleamos el perfil de aceleración 9 y el perfil de desaceleración 7 para minimizar la pérdida celular y mantener la viabilidad.
Viabilidad y recuperación de células T
Métodos
Las células T primarias proporcionadas por donantes sanos se transfirieron a contenedores cónicos de 50 mL y 500 mL a una concentración de 1 × 10⁶ células/mL. El recuento celular se realizó utilizando el dispositivo Via2-Cassette™ y el instrumento NucleoCounter™ NC-200™ (ChemoMetec; Allerød, Dinamarca). Los contenedores se centrifugaron en la centrífuga de uso general Thermo Scientific™ Multifuge™ X4R Pro a 400 × g, a temperatura ambiente durante 10 minutos. La viabilidad y la recuperación de las células T se determinaron después del lavado y la concentración.
Nota: La concentración celular de 1 × 10⁶ células/mL utilizada es de cuatro a cinco veces inferior a los valores habituales, a fin de simular un escenario de peor caso.
Resultados
Nuestros resultados indican que ambos tipos de contenedores cónicos, de 50 mL y 500 mL, funcionan de manera equivalente en la concentración de células T, con una disminución mínima de la viabilidad y altas tasas de recuperación (figura 5).
Figura 5: Viabilidad y recuperación de células T.
Conclusiones
La centrifugación por lotes ha sido la herramienta fundamental en la fabricación de terapias celulares durante décadas. Basándonos en nuestros hallazgos, concluimos que es el método preferido debido a las siguientes ventajas:
Sin limitación en los tipos de células aplicables.
Sin obstrucciones cuando se procesan densidades celulares altas.
Alto rendimiento con baja densidad celular.
Control activo y mantenimiento de la temperatura del proceso.
Baja inversión de capital, con bajo costo de mantenimiento y operación.
Desarrollo de procesos no complicado.
Lo suficientemente flexible para utilizarse en numerosas aplicaciones de laboratorio.
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Número de catálogo 17170579