Enzimas de restricción

La acción principal de una enzima de restricción es cortar el ADN en secuencias específicas conocidas como sitios de reconocimiento. Este proceso implica varios pasos clave:

1. Reconocimiento: La enzima se une a una secuencia específica de ADN. Cada enzima de restricción reconoce una secuencia particular de nucleótidos que es típicamente palindrómica (se lee igual hacia adelante y hacia atrás en las hebras complementarias).
2. Unión: La enzima se une al ADN en el sitio de reconocimiento. Esta unión implica interacciones entre la enzima y la secuencia de nucleótidos específica.
3. Corte: La enzima corta la columna vertebral del ADN en ubicaciones específicas dentro o cerca del sitio de reconocimiento. Este corte puede resultar en "extremos romos" o "extremos cohesivos".
   • Extremos romos: El ADN se corta directamente a través de ambas hebras, resultando en extremos uniformes.
   • Extremos cohesivos: El ADN se corta de manera escalonada, resultando en extremos monocatenarios sobresalientes que pueden emparejarse fácilmente con secuencias complementarias.

Por ejemplo, la enzima de restricción EcoRI reconoce la secuencia palindrómica 5'-GAATTC-3' y corta entre la G y la A en cada hebra, produciendo extremos cohesivos:

Esto resulta en:

5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAA↑G-5’​5’-GAATTC-3’ ​3’-CTTAA↑G-5’​

y

5’-G 3’-CTTAA AATTC-3’ G-5’​5’-G ​3’-CTTAA ​AATTC-3’ ​G-5’​

Las enzimas de restricción se clasifican en cuatro tipos principales según su estructura, secuencia de reconocimiento, sitio de corte y requisitos de cofactores. Aquí hay una descripción de cada tipo:

1. Enzimas de restricción de tipo I
   Estas enzimas cortan el ADN en sitios aleatorios que están lejos de sus secuencias de reconocimiento. Son enzimas complejas, de múltiples subunidades, con actividades tanto de restricción como de modificación (metilación). Reconocen secuencias específicas pero cortan el ADN en sitios que pueden estar a cientos o miles de pares de bases de distancia del sitio de reconocimiento. Requieren ATP y S-adenosilmetionina (SAM) para su actividad.

2. Enzimas de restricción de tipo II
   Estas enzimas cortan el ADN en sitios específicos dentro o cerca de sus secuencias de reconocimiento. Generalmente son más simples, usualmente consisten en una sola subunidad. Reconocen secuencias palindrómicas específicas, típicamente de 4-8 pares de bases de longitud, y cortan el ADN en o cerca de estos sitios. Requieren Mg²⁺ como cofactor pero no necesitan ATP. Estas son ampliamente utilizadas en biología molecular para clonación, mapeo de ADN y otras manipulaciones genéticas debido a sus patrones de corte predecibles y precisos.

3. Enzimas de restricción de tipo III
   Estas enzimas cortan el ADN en sitios a una corta distancia de sus secuencias de reconocimiento. Están compuestas por dos subunidades: una para la restricción y otra para la modificación. Reconocen secuencias específicas y cortan el ADN a 20-30 pares de bases de distancia del sitio de reconocimiento. Requieren ATP para la actividad de restricción y SAM para la actividad de modificación.

4. Enzimas de restricción de tipo IV
   Estas enzimas reconocen y cortan específicamente el ADN modificado, como el ADN metilado o hidroximetilado. Son típicamente complejas, pero la estructura exacta puede variar. Reconocen bases modificadas dentro de secuencias específicas. Generalmente requieren Mg²⁺ como cofactor, pero las especificaciones pueden variar según la enzima.

Las enzimas de tipo II son las más comúnmente utilizadas debido a sus patrones de corte precisos y predecibles.

Al seleccionar enzimas de restricción para una aplicación específica en biología molecular, considere estos cinco puntos clave para garantizar una manipulación exitosa y eficiente del ADN:

1. Secuencia de reconocimiento

Elija una enzima que reconozca una secuencia específica dentro de su ADN de interés. Asegúrese de que la secuencia de reconocimiento esté presente en la ubicación deseada en el ADN y ausente en otras regiones donde no se desea cortar. Considere la longitud de la secuencia de reconocimiento. Las enzimas que reconocen secuencias más largas (por ejemplo, 8 pares de bases) cortan con menos frecuencia que las que reconocen secuencias más cortas (por ejemplo, 4 pares de bases).

2. Patrón de corte

Determine si necesita extremos romos o extremos cohesivos. Los extremos cohesivos son a menudo preferidos para el clonaje porque facilitan la ligación de fragmentos de ADN. Asegúrese de que la enzima corte en la posición deseada dentro o cerca del sitio de reconocimiento.

3. Condiciones de reacción

Verifique los requisitos de tampón para la enzima. Si se utilizan múltiples enzimas en una sola reacción, asegúrese de que exista un tampón compatible o que las condiciones del tampón puedan ajustarse sin pérdida de actividad. Verifique la temperatura óptima para la actividad enzimática. La mayoría de las enzimas de restricción funcionan mejor a 37°C, pero algunas requieren diferentes temperaturas. Algunas enzimas de restricción son sensibles a la metilación del ADN. Asegúrese de que la enzima que seleccione pueda cortar ADN metilado si su muestra de ADN es probable que esté metilada.

4. Actividad estrella

Tenga en cuenta la "actividad estrella", donde una enzima corta en sitios similares pero no idénticos a su secuencia de reconocimiento en condiciones no óptimas (por ejemplo, alta concentración de glicerol, baja fuerza iónica, pH alto). Para minimizar la actividad estrella, use la enzima en condiciones óptimas según lo recomendado por el fabricante.

5. Disponibilidad comercial y costo

Asegúrese de que la enzima esté fácilmente disponible de proveedores confiables. Considere el costo de la enzima, especialmente si se requieren grandes cantidades o múltiples enzimas para sus experimentos. Seleccione enzimas de alta calidad y altamente purificadas para garantizar resultados consistentes y confiables.

Escenario de ejemplo

Por ejemplo, si está clonando un gen en un vector plasmídico, podría seleccionar una enzima como EcoRI que produce extremos cohesivos. Se aseguraría de que la secuencia de reconocimiento (5'-GAATTC-3') esté presente en el sitio de clonación tanto en el gen como en el vector. Verificaría que EcoRI sea compatible con el tampón utilizado en su reacción, funcione de manera óptima a 37°C y no esté inhibido por la metilación si su ADN está metilado.