Habilitación del análisis funcional de la inmunología celular
En condiciones óptimas, el ensayo ELISpot (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en placa) permite la visualización de múltiples productos secretados por una sola célula que responde. Así, el ELISpot proporciona información cualitativa (tipo de proteína inmunitaria) y cuantitativa (número de células que responden). En virtud de la insuperable sensibilidad de este ensayo, el análisis de la frecuencia de poblaciones celulares raras (por ejemplo, respuestas específicas a antígenos), que antes no era posible, ahora es relativamente sencillo. Las mejoras recientes en el diseño de microplacas de pocillos múltiples, incluido el uso de membranas con fluorescencia de fondo reducida, han reforzado la aplicación generalizada de los ensayos ELISpot.
Cuando se consideran conjuntamente la sensibilidad del ensayo, la facilidad de uso y el coste es, probable que la plataforma ELISpot sea la opción superior para el desarrollo de ensayos multifuncionales de células T para las comunidades de investigación, terapéuticas y diagnósticas.
La popularidad de este ensayo ha experimentado un resurgimiento en los últimos años ya que los investigadores intentan obtener una mejor comprensión de las respuestas inmunitarias en una variedad de aplicaciones, incluyendo el estudio de la memoria inmunológica y el desarrollo de vacunas.
Optimización de ELISpot
Aunque los ensayos ELISpot permiten determinar la frecuencia de eventos muy raros, la interpretación de los datos puede volverse ambigua cuando el número de manchas en los pocillos que contienen antígeno es bajo, los recuentos de manchas en los pocillos de control negativo están elevados y, especialmente, cuando ambas cosas ocurren simultáneamente. Por lo tanto, la tarea principal incluso antes de emplear estadísticas debe ser la optimización de los parámetros básicos del ensayo y de los reactivos para maximizar la relación señal-ruido. Aunque el uso de pares de anticuerpos validados específicamente para ELISpot es clave para el éxito del ensayo, es necesario considerar y ejecutar adecuadamente una serie de otros pasos para garantizar un rendimiento óptimo.
Elección de la placa (membrana)
Se recomiendan las placas con membrana de PVDF (N.º de catálogo de Merck: MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) en lugar del formato de éster de celulosa mixto (N.º de catálogo de Merck: MSHAS4510), debido a una ligera mejora en la unión del anticuerpo de captura y a un rendimiento superior en la detección de manchas, especialmente en aplicaciones fluorescentes. La única desventaja de las placas de PVDF es la extrema hidrofobicidad del material, una propiedad que puede requerir un prehumedecimiento con alcohol antes de añadir el anticuerpo de recubrimiento. Dado que la membrana de celulosa mixta es hidrofílica los ensayos ELISpot se pueden realizar sin prehumedecimiento.
Controles negativos/positivos
Los controles pertinentes son cruciales para medir las respuestas específicas al antígeno mediante ELISpot. Los controles negativos consisten habitualmente en células cultivadas sin estímulos, mientras que los activadores policlonales de células T se usan comúnmente como controles positivos para confirmar tanto la funcionalidad celular como la del ensayo. Los controles positivos incluyen anticuerpos anti-CD3/CD28, fitohemaglutinina (PHA) y concanavalina A (ConA). Estos activadores inducen la secreción de muchas citoquinas comunes, incluyendo IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Th2).
Otro control común es el pool de péptidos CEF (citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la influenza). Este consiste en múltiples epítopos de cada uno de los tres virus, frente a los cuales la mayoría de los individuos sanos (~90%) poseen células T CD8 reactivas.
Como solo podemos describir algunos aspectos en este artículo, nos gustaría remitirle a nuestro ELISpot White Paper, donde el protocolo del ensayo se discutirá en detalle con énfasis en las mejores prácticas estándar y la resolución de problemas.
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