Thermo Scientific™ Pierce™ Fluorescent Protease Assay Kit

Estos kits de ensayos colorimétricos y fluorescentes de proteasas incluyen dos métodos diferentes para medir la actividad de las proteasas totales en muestras biológicas. Ambos kits pueden utilizarse para evaluar el progreso de procedimientos de purificación de proteasas o para cuantificar la contaminación por proteasas en muestras de proteínas. Los kits utilizan caseína succinilada o marcada con fluoresceína como sustrato de las proteasas. La proteólisis del sustrato produce péptidos cuyos grupos amino o cuyas propiedades de fluorescencia alteradas permiten la detección en los kits respectivos. La actividad de las proteasas se cuantifica mediante la comparación con un patrón de tripsina incluido en cada kit.

Características destacadas:

• Sustrato de caseína: mide la actividad de cualquier proteasa que escinda la caseína en fragmentos peptídicos

• Patrón de tripsina: cuantifica la actividad proteasa en relación con la tripsina, una referencia universalmente aceptada

• Sensible: 1000 veces más sensible que los ensayos que utilizan formas no modificadas de caseína

• Sencillo y rápido: los protocolos para tubos de ensayos y para microplacas se realizan en menos de una hora

• Homogéneo: con pasos de adición solamente; no requiere pasos de separación, transferencia o parada

• Personalizable: permite adaptar fácilmente el tiempo, la temperatura y el pH para optimizar la sensibilidad a las proteasas de interés

El kit de ensayo colorimétrico de proteasas (referencia 23263) utiliza caseína completamente succinilada como sustrato del ensayo. La hidrólisis de este sustrato en presencia de proteasa provoca la liberación de fragmentos de péptidos con grupos amino terminales libres. Estos péptidos se hacen reaccionar con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBSA), tras lo que se mide el incremento de absorbancia producido por la formación de aductos TNB-péptidos de color amarillo.

• Sustrato: caseína succinilada (no disponible por separado)
• Base del ensayo: detección de aminas primarias resultantes de la proteólisis
• Reactivo de detección: ácido trinitrobencenosulfónico (TNBSA)
• Medición: absorbencia a 450 nm (lector de placas o espectrofotómetro)

El kit de ensayo fluorescente de proteasas (referencia 23266) incluye caseína marcada con fluoresceína como sustrato para determinar la actividad de las proteasas en una muestra, bien mediante transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET) con un fluorímetro estándar, o bien mediante polarización de la fluorescencia (FP) con un equipo adecuado. La FTC-caseína es una caseína natural que se ha marcado utilizando un gran exceso molar de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las propiedades de fluorescencia de este sustrato de proteínas intactas muy marcadas cambian considerablemente tras la digestión por proteasas, lo que permite medir el grado de proteólisis.

• Sustrato: caseína etiquetada con fluoresceína (FITC-caseína); disponible por separado con la referencia 23267
• Base del ensayo: cambio en la resonancia de la fluorescencia (FRET) o la polarización de la fluorescencia (FP)
• Medición: instrumento con filtros de excitación y emisión de fluoresceína (485/538 nm)

Incluye:

Caseína modificada, patrón de tripsina y solución salina tamponada con Tris (ambos kits); solución de TNBSA (referencia 23263 solamente)

Recomendada para:

Evaluar la integridad funcional y el progreso global de la purificación de proteasas; Cuantificar la contaminación por proteasas en muestras de proteínas; Caracterizar la actividad de proteasas poco comunes mediante comparación con tripsina; Evaluar las condiciones de los tampones en relación con sus efectos sobre la función y la actividad de las proteasas