Thermo Scientific™ Medio de limitación Dulbecco con modificación de Eagle (DMEM/LM)

La L-foto-leucina y la L-foto-metionina Thermo Scientific son análogos de los aminoácidos L-leucina y L-metionina que tienen cadenas laterales activables de diazirina capaces de entrecruzarse químicamente con moléculas adyacentes cuando se exponen a la luz ultravioleta. Al igual que sus equivalentes naturales, estos aminoácidos fotorreactivos se pueden incorporar de manera endógena en la secuencia primaria de proteínas durante la síntesis. Los dominios de interacción entre proteínas que involucran las proteínas sintetizadas en sus ambientes nativos pueden entonces entrecruzarse de forma covalente mediante la activación de los grupos diazirina. Los experimentos tradicionales de entrecruzamiento requieren la incorporación de entrecruzadores químicos bifuncionales y disolventes de reactivos asociados, que pueden afectar negativamente a la biología celular que se está estudiando. El uso de aminoácidos fotorreactivos minimiza estos efectos potencialmente adversos y permite que las interacciones entre las proteínas estables y transitorias de las células se estudien y caractericen con un alto grado de fiabilidad. Cuando se utilizan en combinación con los medios celulares limitantes especialmente formulados que carecen de leucina y metionina, el equipo de síntesis de proteína procesa los derivados fotoactivables como aminoácidos naturales. Como resultado, se pueden sustituir por leucina o metionina en la secuencia primaria de proteínas. Cuando se exponen a la luz ultravioleta, los anillos de diazirina se convierten en intermediarios reactivos que forman enlaces covalentes con las cadenas laterales de proteínas y las cadenas principales cercanas. Los elementos de unión asociados de manera natural quedan atrapados al instante. Los complejos de proteínas entrecruzados se detectan mediante una disminución de la movilidad en SDS-PAGE seguida de la detección por Western blot, cromatografía de exclusión de tamaño, sedimentación de gradiente de densidad de sacarosa o espectrometría de masas.

Características destacadas:

• Etiquetado in vivo: incorpore el grupo fotorreactivo en proteínas mediante instrumentos celulares normales.

• Entrecruzamiento in vivo: detecte proteínas que interactúan en el ambiente celular nativo.

• Mayor especificidad en comparación con los métodos tradicionales: entrecruce interacciones de proteínas correctamente ubicadas en sus interfaces dentro de los dominios de interacción de proteínas.

• Complementa los métodos tradicionales: proporciona una caracterización detallada de las interacciones de proteínas en comparación con los resultados con formaldehído y otros enfoques de entrecruzamiento más generales.

• Recuperación eficaz: permite recuperar las proteínas al 90 % en lisados celulares después del entrecruzamiento.

• Compatible: permite entrecruzar proteínas expresadas en una amplia variedad de líneas celulares, incluidas HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3 y C6.

• Fácil de usar: los reactivos son fotoestables bajo una iluminación normal de laboratorio, eliminando así la necesidad de trabajar en la oscuridad.