Thermo Scientific™ Sonda de destiobiotina-GTP ActivX™

Las sondas destiobiotina-GTP ActivX™ contienen una biotina modificada unida al nucleótido por un enlace de acilo-fosfato lábil. Las sondas de enriquecimiento del sitio activo ActivX son ventajosas para determinar los niveles de enzimas activas mediante el uso de sondas etiquetadas con análogos para permitir el perfilado de enzimas activas e inactivas. Las sondas ActivX enriquecen selectivamente solo a aquellas enzimas que son funcionalmente activas y biológicamente relevantes en el momento del etiquetado. Con el enriquecimiento selectivo, se pueden identificar y perfilar las clases de enzimas objetivo en las muestras o se puede evaluar la especificidad y la afinidad de los inhibidores de enzimas.

Después de la eliminación de los nucleótidos GTP o GDP de las enzimas, la sonda destiobiotina-GTP puede utilizarse para modificar covalentemente los residuos de lisina conservados en el sitio de unión de nucleótidos GTPasa. La destiobiotina-GTP puede enriquecer, identificar y perfilar selectivamente las clases de enzimas diana en las muestras. La incubación previa de muestras con inhibidores de moléculas pequeñas que compiten con las sondas del sitio activo puede usarse para determinar la afinidad de unión de inhibidores y la especificidad de los objetivos. La sonda ActivX Desthiobiotin-GTP marca covalentemente el sitio activo de las GTPasa y las subunidades de GTPasa de los receptores acoplados a proteína G.

Aplicaciones de la sonda ActivX destiobiotina-GTP:
• Amplio enriquecimiento de proteínas de unión a GTP de tejidos, células y proteomas subcelulares
• Amplio enriquecimiento de proteínas de unión a GTP de tejidos, células y proteomas subcelulares
• Perfilado de decenas a cientos de objetivos inhibidores

La evaluación del etiquetado de sitios activos con sondas de destiobioina puede realizarse mediante Western blot o espectrometría de masas (MS). Para el flujo de trabajo Western blot, las proteínas etiquetadas con destiobiotina se enriquecen para el análisis SDS-PAGE y la posterior detección con anticuerpos específicos. Para el flujo de trabajo de MS, las proteínas etiquetadas con destiobiotina se reducen, se alquilan y se digieren enzimáticamente a péptidos. Solo los péptidos de sitio activo etiquetados con destiobiotina se enriquecen para su análisis mediante LC-MS/MS. Ambos flujos de trabajo se pueden usar para determinar la unión del objetivo del inhibidor, pero solo el flujo de trabajo de MS puede identificar los objetivos globales del inhibidor y los objetivos secundarios.

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