Kit de expresión de Pichia de varias copias

• El kit de expresión de Pichia de varias copias contiene los vectores pPIC3.5K, pPIC9K y pAO815 para la producción y selección de cepas de Pichia que contienen más de una copia del gen de interés
• En muchos casos, el aumento del número de copias ha llevado a un aumento de los niveles de expresión
• Estos vectores también están disponibles por separado

pPIC9K y pPIC3.5K

• Los vectores pPIC9K y pPIC3.5K porta el gen resistente a la kanamicina que confiere resistencia al reactivo Geneticin™ en Pichia
• La generación espontánea de múltiples eventos de inserción puede ser identificada por resistencia al aumento de los niveles de reactivo Geneticin™
• Los transformantes de Pichia se seleccionan en un medio con deficiencia de histidina y se criban para determinar su nivel de resistencia al reactivo Geneticin™
• La capacidad para crecer en altas concentraciones de Geneticin™ indica que hay múltiples copias del gen resistente a la kanamicina y del gen de interés integrados en el genoma
• El vector pPIC9K dirige la secreción de proteínas expresadas mientras que las proteínas expresadas a partir de pPIC3.5K permanecen intracelulares.

pAO815

• pAO815 es un vector de expresión Pichia diseñado para clonar múltiples copias de un gen en un solo vector
• El vector contiene un sitio Bgl II en el proceso anterior del gen 5´ AOX1 y un sitio único BamH I en el proceso posterior de la señal de la terminación de la transcripción (TT) de 3´ AOX1
• Es necesario realizar cuatro pasos para generar múltiples copias del gen de interés:
  • 1. El gen se clona en el sitio único EcoR I en el vector.
  • 2. La construcción se digiere con BamH I y Bgl II para liberar el «cassette de expresión» que contiene el promotor AOX1, el gen de interés y la TT de 3´ AOX1.
  • 3. Los concatémeros del cassette de expresión se generan por ligación in vitro.
  • 4. Las copias múltiples se insertan de nuevo en el vector pAO815 y se transforman en Pichia.