Invitrogen™ Histone Demethylase Fluorescent Activity Kit

El kit de la actividad de la demetilasa de histona (para uso exclusivo en investigación) es un ensayo de actividad fluorescente y está diseñado para la detección y cuantificación de la actividad de la demetilasa histona de la demetilasa 1 histona específica de lisinas (LSD1) y demetilasa de tipo Jumonji.

Este kit incluye placas negras de 96 pocillos, tampones de ensayo LSD1/JMJD2A, estándar de formaldehído y otros componentes para realizar el ensayo. Este kit no contiene muestras de enzima demetilasa. El usuario debe suministrar una fuente de demetilasa de tipo LSD1 o Jumonji, junto con cualquier cofactor, sustrato enzimático, inhibidor o activador. Para utilizar este kit se necesita un lector de microplacas de fluorescencia de 96 pocillos capaz de leer emisiones fluorescentes a 510 nm, con excitación a 450 nm.

Características de rendimiento
• Tipo de ensayo: kit de actividad fluorescente
• Tipos de muestras: demetilasa-1 histona específica de lisina (LSD1) y demetilasas de tipo Jumonji
• Sensibilidad: 0,128 uM–0,64 μM para LSD1, 2,5–10 μM para JMJD2A
• Reactividad: humana

Antecedentes
La demetilasa histona (HDM) cataliza la desmetilación específica del sitio de residuos de metil-lisina en histonas para regular dinámicamente la estructura de la cromatina, la expresión génica y, potencialmente, otras funciones genómicas. Las HDM específicas de la lisina se descubrieron por primera vez en 2004 y, actualmente, se encuentran entre las enzimas productoras de formaldehído más estudiadas. En la actualidad, existen dos clases conocidas de HDM: la familia de la demetilasa-1 específica de lisinas (LSD1) dependiente de la flavina y adenina (FAD) y la familia de la demetilasa de tipo Jumonji C (JmjC) dependiente de Fe(II). Aunque las HDM de tipo LSD1 y de tipo JmjC emplean cofactores y mecanismos catalíticos distintos, ambas producen formaldehído como subproducto derivado de la reacción de desmetilación.

A pesar de su importancia biológica, las HDM han demostrado ser difíciles de analizar cuantitativamente debido a su bajo nivel de renovación, lo que dificulta la comprensión de sus propiedades cinéticas, sus características específicas de sustrato y sus mecanismos de reacción. Este ensayo se ha validado para su uso con la demetilasa-1 de histona específica de lisinas (LSD1) y la demetilasa de tipo Jumonji. Para las muestras de HDM en lisados celulares, se incluye un tampón de lisis celular especialmente formulado, que, según los resultados de las pruebas, no interfiere en la detección del formaldehído. Los tampones de lisis celular que contienen SDS y Triton X-100 inhiben la reacción de la señal de formaldehído y no deben usarse.

Principio del ensayo
El kit de actividad de la demetilasa de histona mide cuantitativamente la actividad enzimática de enzimas productoras de formaldehído, como las demetilasas de histona. La exclusividad de este kit se basa en el hecho de que el producto derivado de estas reacciones de desmetilación enzimática, el formaldehído, se cuantifica directamente mediante un producto fluorescente. No se requiere separación ni lavado. El kit se ha validado tanto para las demetilasas de histonas (HDM) del tipo LSD1 como para las del tipo JMJD2A.

El kit proporciona tampones optimizados para las HDM de LSD1 y de JMJD2A, un estándar estable de formaldehído, el reactivo de detección de formaldehído (FDR) y dos placas de 96 pocillos para detectar la señal fluorescente generada. El kit permite medir cualquier reacción enzimática que genere formaldehído. El usuario final deberá proporcionar el sistema de demetilasa y los cofactores necesarios para la actividad, junto con cualquier inhibidor o activador de la prueba. El kit permite a los usuarios finales generar actividad de HDM en muchos sistemas in vivo e in vitro para determinar la actividad midiendo la producción de formaldehído. Para los estudios in vitro, la reacción de HDM debe realizarse en los tampones suministrados en condiciones de reacción optimizadas para la desmetilación.

Una vez se produzca la reacción que genera el formaldehído, se puede detener añadiendo un inhibidor adecuado. A continuación, se añade el FDR a todos los pocillos. Si es necesario calibrar el formaldehído (para comparaciones entre laboratorios), se debe obtener una curva estándar de formaldehído generada a partir del estándar suministrado. Después de una corta incubación a 37 °C durante 30 minutos, el producto fluorescente se lee a 510 nm en un lector de placas fluorescentes con excitación a 450 nm.