Thermo Scientific™ AarI (2 U/μl)

5'...C A C C T G C (N)₄▵...3'

3'...G T G G A C G (N)₈▵...5'

Condiciones para una actividad del 100 %:

• [1 tampón AarI] + oligonucleótido:
• [10 mm de bis-Tris Propane-HCl (pH 6,5 a 37 °C), 10 mm de MgCl₂, 100 mm de KCl, 0,1 mg/ml de BSA] + 0,5 μM de oligonucleótido (ver Nota)
• Incubar a 37 °C.

Tampón de almacenamiento:

• AarI se suministra en:
• 10 mm de fosfato potásico (pH de 7,4 a 25 °C), 100 mm de KCl, 1 mm de EDTA, 1 mm de DTT, 0,2 mg/ml de BSA y 50 % (v/v) de glicerol

Ligadura y refragmentación:

• Tras una sobredigestión con 10 veces la cantidad recomendada de AarI, más del 95 % de los fragmentos de ADN pueden ligarse y recortarse

Efectos de metilación:

• Dam: nunca se solapa, sin efecto.
• Dcm: nunca se solapa, sin efecto.
• CpG: puede solaparse, reducción de fragmentación.
• EcoKI: nunca se solapa, sin efecto.
• EcoBI: puede solaparse, efecto sin determinar.

Digestión del ADN integrado en agarosa:

• Se requieren como mínimo 5 unidades de la enzima para la digestión de 1 μg de ADN lambda integrado en agarosa en 16 horas

Nota:

Si desea realizar una fragmentación con AarI, necesitará al menos dos copias de su secuencia de reconocimiento. La inclusión de 0,5 μM de oligonucleótido con la secuencia de reconocimiento de AarI en la mezcla de reacción mejora significativamente la fragmentación del ADN, especialmente de aquellos con un solo punto de reconocimiento de AarI. Aún así, es difícil conseguir una fragmentación completa de algunos sustratos con AarI. Una sobredigestión con más de 10 veces la cantidad recomendada de AarI puede provocar una actividad estrella (star activity). AarI puede permanecer asociada al ADN fragmentado, lo que puede provocar un desplazamiento de las bandas de ADN durante la electroforesis. Para evitar patrones atípicos de las bandas de ADN, use colorante de carga de ADN 6X y solución SDS para la preparación de muestras o caliente el ADN digerido en presencia de SDS antes de la electroforesis.