Invitrogen™ Ensayo de proliferación Click-iT™ EdU para microplacas

Tras la incorporación de EdU (un análogo de timidina modificado) en el ADN recién sintetizado, la peroxidasa de rábano picante (HRP) se une covalentemente a través de la reacción de clic altamente específica. A continuación, se añade el reactivo Amplex UltraRed, un sustrato de HRP, y se detecta la señal de fluorescencia resultante. Debido a la fijación altamente específica de HRP a EdU, este ensayo da como resultado una medición altamente sensible y fiable de la proliferación de células de mamíferos en un formato de microplaca.

Las características del ensayo de proliferación de EdU Click-iT para microplacas incluyen:
• Mejor rendimiento: la conjugación directa de HRP con EdU incorporado mejora la sensibilidad y la precisión del ensayo
• Mayor fiabilidad: el formato del ensayo da como resultado una baja variabilidad de pozo a pozo
• Protocolo simplificado: da como resultado una reducción del tiempo de obtención de los datos; es un protocolo más fácil de seguir
• Multiplex activado: el ensayo se puede multiplexar fácilmente con otros reactivos de salud celular, lo que da como resultado más datos por muestra

La medición de la proliferación celular es un método fundamental para evaluar la salud celular, determinar la genotoxicidad y evaluar los fármacos contra el cáncer. El método más preciso para medir la proliferación es la detección directa de la síntesis de ADN. Originalmente, este procedimiento se realizaba mediante la incorporación de un nucleósido radiactivo (p. ej., la ³H-timidina). Este método fue reemplazado por la detección basada en anticuerpos del análogo nucleósido bromodesoxiuridina (BrdU). Tras la incorporación de BrdU en el ADN recién sintetizado, se requiere la desnaturalización para exponer las moléculas de BrdU al anticuerpo anti-BrdU. La desnaturalización implica métodos duros (HCl, calor o enzimas), lleva mucho tiempo y es difícil de realizar de forma constante.

El ensayo de proliferación de EdU Click-iT es una alternativa al ensayo BrdU. El análogo nucleósido EdU (5-etinil-2´-desoxiuridina) se añade a las células vivas y se incorpora al ADN durante la síntesis activa del mismo. La EdU incorporada contiene un grupo de alquinos que se une covalentemente al grupo de azidas presente en el HRP mediante una reacción covalente altamente específica catalizada por el cobre («reacción de clic»). A continuación, se añade el reactivo Amplex UltraRed y su conversión por HRP en un producto altamente fluorescente se registra mediante un lector de microplacas de fluorescencia (excitación: 568, emisión: 585 nm). Con un alto coeficiente de extinción, una buena eficiencia cuántica y resistencia a la autooxidación, el reactivo Amplex UltraRed proporciona una mayor sensibilidad y un rango de ensayo más amplio que otros sustratos de HRP fluorogénicos o colorimétricos. También ofrece versatilidad a través de la detección gracias a la medición de la fluorescencia o la absorbancia.