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El LeukoLOCK™ es un método innovador para el fraccionamiento celular de sangre completa y estabilización y extracción de ARN total de la población de leucocitos. El kit está compuesto por un kit de fraccionamiento y estabilización LeukoLOCK (también disponible por separado; n.° de cat. AM1933) y un kit de aislamiento de ARN total LeukoLOCK.
El sistema LeukoLOCK está optimizado para su uso con sangre humana. La sangre es un almacén de información celular, pero la presencia de ARNm de globina en el ARN preparado a partir de sangre completa puede interferir con las aplicaciones posteriores de análisis de expresión. El sistema LeukoLOCK emplea tecnología de eliminación de leucocitos basada en filtros para aislar leucocitos de sangre completa y la solución de ARNlater™ para estabilizar las células en el filtro. Al excluir los glóbulos rojos, el ARN purificado a partir de leucocitos capturados no tiene ARNm de globina, lo que mejora la utilidad de la muestra para el perfilado de expresión y otras aplicaciones.
Estabilización y captura de leucocitos Una muestra de 9 a 10 ml de sangre anticoagulada se pasa a través de un filtro LeukoLOCK, que captura la población total de leucocitos y elimina los glóbulos rojos (incluidos los reticulocitos), las plaquetas y el plasma. Después de enjuagarse con solución salina tamponada con fosfato, el filtro se enjuaga con la solución de ARN later para estabilizar el ARN en los leucocitos capturados. El ARN puede aislarse inmediatamente, o las células estabilizadas pueden mantenerse durante varios días a temperatura ambiente o durante periodos más largos a –20 °C o –80 °C.
Aislamiento del ARN La purificación del ARN se realiza primero interrumpiendo las células capturadas en una solución basada en tiocianato de guanidinio que libera el ARN mientras inactiva simultáneamente las nucleasas. El lisado celular se recoge y se trata brevemente con Proteinasa K. El ARN se purifica a partir del lisado mediante la tecnología de lavado basada en gránulos magnéticos MagMAX, seguida por el tratamiento con ADNasa (con TURBO DNase™) y la limpieza final.
Estudios de expresión Tanto la RT-PCR cuantitativa como los estudios de expresión de micromatrices han validado la idoneidad del ARN purificado para el perfilado fiable del transcriptoma. En comparación con el ARN procesado con un procedimiento de aislamiento de ARN en sangre de uso común, el ARN aislado con el sistema LeukoLOCK produce un ARNa medio más largo después de la amplificación y un porcentaje más alto de llamadas presentes sin necesidad de más pasos posteriores a la extracción para eliminar el ARNm de globina. Dado que el ARNa de la globina representa un porcentaje del 25 al 40 % del pico de ARNa a partir del ARN total de sangre completa, el rendimiento del ARN total es comprensiblemente inferior con métodos que agotan transcripciones de globina no deseadas. El ARN amplificado después de la purificación de LeukoLOCK ofrece una mayor sensibilidad de matriz debido a la drástica reducción en transcripciones de globina competidoras.
Producción del kit La recuperación varía de donante a donante, pero es normalmente de 10 a 20 μg de ARN por una cantidad de 9 a 10 ml de sangre completa. El ARN recuperado mediante el sistema LeukoLOCK contiene menos de una décima parte de la cantidad de ARNm de globina alfa y beta derivados de reticulocitos presentes en muestras típicas de ARN de sangre completa no fraccionada.
Fracciona leucocitos de sangre completa en minutos
Extrae el ARN total de los leucocitos
No se requieren pasos adicionales de reducción de la globina
Estabiliza el ARN para preservar el perfil de expresión
Conserva los leucocitos a temperatura ambiente durante días
No compatible con alto rendimiento (manual)
Purificación y análisis de ADN y ARN, extracción de ARN, aislamiento de ARN total, ARN total de células y tejidos animales, ARN total de sangre
Almacene 1X PBS pH 7,4, ARNlater;™ Solución, tapón septo de caucho, conector deslizante blanco, pico de transferencia, filtro LeukoLOCK™, solución de elución, solución de unión⁄lisis LeukoLOCK™, solución de ajuste de pH LeukoLOCK™, tubos de procesamiento, concentrado de solución de lavado 1, concentrado de solución de lavado 2⁄3 y agua sin nucleasas a temperatura ambiente. Almacene los gránulos de unión de ARN a 4 °C. Almacene el tampón de DNasa 1X LeukoLOCK™, proteinasa K y TURBO™DNasa a -20 °C.
Células, sangre
No compatible con alto rendimiento (manual)
20 preparaciones
Ambion™, LeukoLOCK™
Hasta 10 ml de sangre completa
Filtro de captura de leucocitos, gránulo magnético
ARN total
Análisis de micromatrices, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), ensayos de protección de nucleasas, Northern Blotting, construcción de biblioteca de ADNc
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