La tecnología de bioimpresión ha crecido junto con la investigación de células madre y se ha convertido en una herramienta vital con diversas aplicaciones en los campos biológico y médico. Las técnicas de cultivo celular 3D in vitro crean un entorno in vitro preciso y proporcionan una alternativa a los modelos in vivo utilizados para la investigación fundamental de la biología celular y la fisiología. Sin embargo, actualmente estas aplicaciones se ven obstaculizadas por la variabilidad de los organoides, el bajo rendimiento y la escala limitada. Aunque se espera que la tecnología de bioimpresión se aplique en la medicina regenerativa y el descubrimiento de fármacos, persiste la preocupación por el impacto de los dispensadores celulares en la integridad de las células.
Bioimpresión con suspensiones celulares y fragmentos de organoides intestinales
La bioimpresora Corning™ Matribot™ mostró un rendimiento de dispensación respetuoso con las células similar al de la operación de dispensación manual. El cultivo dispensado por la bioimpresora Corning™ Matribot™ fue adecuado para posteriores análisis moleculares y de proteínas, así como para aplicaciones posteriores, incluido el cribado de fármacos de alto rendimiento.
La matriz Corning Matrigel™ se descongeló previamente y se alicuotó de acuerdo con el manual. Todas las puntas y jeringas utilizadas para manipular esferoides u organoides se enfriaron previamente. Los medios se equilibraron a temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C) antes de su uso. Las células A549 y MDCK se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 10% de suero bovino fetal hasta que alcanzaron una confluencia del 90%.
El medio se eliminó por aspiración y las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y se disociaron en células individuales utilizando tripsina-EDTA al 0,25%. A continuación, se añadió a las células un volumen igual de medio completo y se mezcló. La suspensión se centrifugó a 300 x g durante 3 minutos, se desechó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en matriz Corning Matrigel™ sin diluir.
A continuación, se añadió a las células un volumen igual de medio completo (DMEM + 10% FBS) y se mezcló. La suspensión se centrifugó a 300 x g durante 3 min, se desechó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en matriz Corning Matrigel™ sin diluir. La densidad celular final se ajustó a 50 células/μL. La mezcla de la matriz de Matrigel y las células se transfirió a una jeringa, se insertó en el cabezal de impresión de la bioimpresora Corning Matribot y se dispensó utilizando los parámetros indicados en la Tabla 1. La dispensación manual se realizó con una pipeta monocanal. Las placas se incubaron a 37°C durante 15 min., seguido de la adición de medio completo (1 mL) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37°C y 5% de CO2, y el medio se cambió cada 2 o 3 días.
"Demostramos que los cultivos 3D dispensados mediante el uso de la bioimpresora Corning™ Matribot™ eran comparables a los obtenidos mediante operación manual. Ambos métodos habían traído morfología similar, tipos de células componentes y el perfil de expresión génica."
Los organoides intestinales de ratón (MIO) se descongelaron, cultivaron y pasaron en medio completo de crecimiento de organoides IntestiCult™, según las instrucciones del fabricante, hasta alcanzar una densidad aproximada de 150 organoides/pocillo. Se utilizó una pipeta de 1.000 μL previamente humedecida para romper los organoides pipeteando arriba y abajo 20 veces, seguido de centrifugación a 290 x g durante 5 min. a 4°C. El sobrenadante se desechó cuidadosamente y el pellet se resuspendió en matriz Matrigel™ sin diluir pipeteando arriba y abajo 10 veces. La mezcla de matriz Matrigel™ y suspensión MIO se transfirió a una jeringa, se insertó en el cabezal de impresión de la bioimpresora Corning Matribot y se dispensó. La dispensación manual se realizó con una pipeta monocanal. Las placas se incubaron a 37 °C durante 15 minutos, tras lo cual se añadió a cada pocillo el medio completo de crecimiento de organoides IntestiCult (1 mL). El medio se cambió tres veces por semana.
Resultados y discusión
La morfología de los esferoides A549 generados a partir de muestras dispensadas por bioimpresora y dispensadas manualmente parecía tener formas normales. Tras 7 días de cultivo, los esferoides MDCK dispensados con bioimpresora y dispensados manualmente mostraron estructuras quísticas obvias y típicas (Figura 1B). También se observaron estructuras MIO complejas y multilobuladas tras 5 días de cultivo. Además, las densidades de los cultivos 3D formados eran comparables entre las muestras dispensadas por bioimpresora y las dispensadas manualmente.
Se realizaron tinciones de inmunofluorescencia para investigar la presencia de marcadores de tipos celulares específicos en los cultivos 3D. Se observó una cantidad significativa de F-actina de unión en los puntos de contacto célula-célula dentro de los esferoides de A549, lo que indica que se formaron interacciones adhesivas intercelulares estables y fuertes. Además, los cultivos 3D de células A549 mostraron una marcación brillante y continua de E-cadherina en la superficie celular y en los puntos de contacto célula-célula. Por lo tanto, la tinción de inmunofluorescencia confirmó que la F-actina y la E-cadherina estaban altamente expresadas en los esferoides A549 generados tanto por bioimpresión como por dispensación manual.
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