Cómo tener éxito con aplicaciones de terapia génica cuando la reproducibilidad experimental es crítica

Existen enfoques científicos interminables y procedimientos técnicos complejos involucrados en un proceso y, como consecuencia, un resultado experimental puede ser difícil de replicar. Todas las partes involucradas en el desarrollo y la entrega de medicamentos de próxima generación necesitan basarse en evidencias sólidas derivadas de datos sobre sus beneficios con el fin de respaldar la toma de decisiones y asegurar la traducción de descubrimientos prometedores a terapéuticas efectivas.

Aquí, destacamos algunos obstáculos para lograr la reproducibilidad experimental que están asociados con el equipo de laboratorio y proporcionamos recomendaciones sobre cómo se pueden superar. Alcanzar el más alto nivel de uniformidad entre las prácticas comunes de laboratorio es absolutamente imprescindible. Esto significa que los científicos de laboratorio deben estar suficientemente capacitados y seguir estrictamente los procedimientos correctos para operar y mantener el equipo de laboratorio. En entornos de investigación académica, estos protocolos son diseñados por los responsables de laboratorio basándose en las recomendaciones que se encuentran en los manuales de usuario proporcionados por los proveedores de equipos. Dado que no existen reglas específicas a seguir, las prácticas académicas pueden variar drásticamente. Thermo Fisher Scientific reconoce la necesidad de brindar soporte adicional en forma de una variedad de materiales completos incluyendo notas técnicas, de aplicación y notas inteligentes que cubren todos los aspectos del uso y mantenimiento del equipo. Todo con el objetivo de permitirle aprovechar al máximo su equipo y aumentar la reproducibilidad de sus datos experimentales.

Mejorando las prácticas de laboratorio a escala de investigación

Producción de plásmidos

En un entorno académico, los plásmidos que codifican vectores virales suelen producirse en células bacterianas Escherichia coli en agitadores orbitales, como los Thermo Scientific™ Solaris™ Benchtop Temperature Controlled Shakers. Si el objetivo es obtener plásmidos de alta calidad, en cantidad y de manera reproducible, se deben tener en cuenta algunas características clave. Por ejemplo, se ha demostrado que velocidades de agitación de hasta 400 rpm producen mayores rendimientos y que limitar la circulación de microorganismos, que podrían contaminar el cultivo, es importante para garantizar la integridad del producto final. De manera similar, las características que facilitan la limpieza regular y sencilla aseguran que no queden contaminantes residuales en las superficies. Además, la posibilidad de visualizar y modificar simultáneamente los parámetros mientras el agitador está en funcionamiento es beneficiosa para garantizar el control de calidad. Se dispone de una nota inteligente¹ dedicada a consideraciones importantes al evaluar un gran agitador orbital para la producción de ADN plasmídico.

Las suspensiones se deben agitar a diferentes velocidades y con diferentes órbitas según el tipo de vaso de cultivo y de célula, por lo tanto, elegir el agitador orbital adecuado para su aplicación es crítico². Otros elementos, como la correcta instalación del agitador, la operación y las mejores prácticas de producción celular, los procesos de limpieza y desinfección y el mantenimiento preventivo regular también son fundamentales para aumentar la reproducibilidad experimental³. Thermo Fisher Scientific siempre va un paso adelante y ha invertido mucho tiempo y recursos en optimizar los protocolos más necesarios (por ejemplo, la producción de ADN plasmídico en E. coli⁴), por lo que usted no necesita hacerlo. Puede aumentar la eficiencia y, al mismo tiempo, la reproducibilidad experimental probando e implementando potencialmente estos protocolos en su laboratorio.

Otras actividades críticas en la preparación de ADN plasmídico son la pelletización de células bacterianas y la extracción y purificación del plásmido. En un entorno académico, la centrifugación sigue siendo la forma más popular y rentable de ejecutar estos pasos. Por ejemplo, el ADN plasmídico puede aislarse en un gradiente de cloruro de cesio, pero este método requiere un ultracentrífugo como el Thermo Scientific™ Sorvall™ WX+ y utiliza bromuro de etidio. Alternativamente, los kits de gravedad o columnas de spin pueden purificar eficazmente el ADN plasmídico en centrífugas superspeed y microcentrífugas. Para aumentar la reproducibilidad de su protocolo, se pueden usar en conjunto un Thermo Scientific™ Sorvall™ LYNX 6000 Superspeed Centrifuge y Thermo Scientific™ Fiberlite Carbon Fiber Rotors junto con kits comerciales de preparación de ADN para obtener ADN plasmídico de alta calidad a gran escala (aproximadamente 1 mg). Alternativamente, está disponible un método de menor costo sin usar kit. Ambos protocolos han sido optimizados y las recomendaciones son fácilmente accesibles en forma de nota de aplicación⁵.

Además, Thermo Fisher Scientific proporciona manuales de usuario completos para todos sus modelos de centrífugas, como el LYNX⁶, que incluyen recomendaciones de desinfección, descontaminación, autoclave y mantenimiento, las cuales se pueden traducir fácilmente en procedimientos paso a paso.

De este modo, no solo puede aumentar la vida útil de la centrífuga, sino también mejorar la tasa de éxito y la reproducibilidad de los procedimientos de extracción de plásmidos. Además, si planea pasar de operaciones de investigación a un entorno regulado por GLP/GMP en el futuro, el Thermo Scientific™ Centri-Log™ Plus Data Management Software⁷ puede incorporarse a las centrífugas Sorvall™ LYNX para permitir la recopilación precisa de datos y la trazabilidad en cumplimiento con las normas 21 CFR Parte 11 sobre registro electrónico de datos.

Producción de vectores virales

Desarrollar y optimizar su plataforma de producción de lentivirus para crear protocolos de transfección robustos puede volverse muy complejo, especialmente cuando sus prioridades son el alto rendimiento, la escalabilidad y la reproducibilidad. Todos los componentes, incluidos los medios de cultivo, los reactivos de transfección, los suplementos y las células, deben trabajar en perfecta sinergia para generar partículas lentivirales superiores y funcionales. Las aplicaciones de investigación, como la creación de nuevas terapias génicas, dependen en gran medida del crecimiento celular de alta calidad. Un ejemplo ilustrativo es el uso de cultivos adherentes o en suspensión para células de producción viral HEK 293. Si las células no se cultivan en condiciones óptimas, tanto la lectura experimental como la reproducibilidad se verán afectadas de manera negativa y difícil de detectar.

Los atributos de calidad del producto celular final, es decir, las partículas virales, pueden variar considerablemente según las condiciones de cultivo mantenidas en el incubador de CO2. De hecho, la reproducibilidad del cultivo puede verse significativamente afectada por la implementación de diferentes características y tecnologías en el diseño del incubador de CO2. A medida que las células responden a señales cambiantes o diferentes, es crucial que las condiciones en la cámara de cultivo sean uniformes de arriba a abajo y de lado a lado, de modo que todas las células experimenten las mismas condiciones. Es aún más importante que el incubador recupere rápidamente las condiciones deseadas después de abrir la puerta, de manera que las células pasen el máximo tiempo posible en sus parámetros ideales, acelerando el tiempo de duplicación y ayudando a garantizar la calidad. Las condiciones ideales para la salud y el crecimiento celular no solo están relacionadas con la temperatura, ya que el nivel de CO2, el nivel de oxígeno y la humedad relativa (HR) también son importantes, ya que todos influyen en la salud celular. Los incubadores que garantizan uniformidad y recuperación rápida, como las Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS CO₂ y Forma™ Steri-Cycle™ CO₂, ayudarán a aumentar la reproducibilidad lote a lote. Además, Thermo Fisher Scientific proporciona información sobre buenas prácticas para el cuidado y mantenimiento adecuados de su incubador de cultivo celular, incluyendo consejos sobre instalación y posicionamiento en el laboratorio, reducción de contaminaciones y procedimientos de desinfección, así como recomendaciones sobre el tipo correcto de agua a utilizar. Todo con el objetivo de garantizar resultados experimentales de calidad que impulsen su investigación.⁸,⁹

Si cultiva sus células de producción lentiviral HEK 293 en suspensión, se puede beneficiar del uso de un agitador orbital resistente al CO2 de pequeña huella. Ideal para su uso en un incubador de CO2, estos agitadores tienen componentes mecánicos especialmente tratados para soportar hasta un 20% de CO2 y un 95% de humedad. En comparación, la mayoría de los agitadores orbitales de aire abierto no están diseñados para soportar las condiciones ácidas de una cámara de CO2 y se deben reemplazar con regularidad. Los Thermo Scientific™ CO₂-Resistant Orbital Shakers también están diseñados para disipar un calor mínimo, garantizando que las condiciones dentro de la cámara del incubador de CO2 no se vean afectadas. La elección correcta del agitador orbital para su aplicación puede prolongar su vida útil y asegurar que se mantengan las condiciones óptimas de crecimiento y la reproducibilidad de los resultados del cultivo.

Conclusiones

Existen muchos ejemplos de equipos de laboratorio presentes en la investigación de terapias génicas que quizá no se consideren, pero que tienen un potencial significativo para afectar la reproducibilidad de sus resultados experimentales. La lección más importante es prestar más atención y dedicar más tiempo a familiarizarse con las recomendaciones del proveedor, tal como se presentan en los manuales de usuario y en las diversas notas técnicas. En entornos de investigación experimental, es común centrarse principalmente en protocolos experimentales específicos, ignorando recomendaciones concretas sobre la instalación del equipo y su correcta ubicación, así como sobre cuidado y mantenimiento preventivo, prevención de contaminación y limpieza y desinfección. Recuerde que incluso equipos de laboratorio como cabinas de bioseguridad, centrífugas, incubadores, agitadores, frigoríficos y congeladores deben ser tratados con respeto y mucho cuidado. Se deben convertir en un socio en su camino para hacer que sus experimentos sean tanto más exitosos como más reproducibles.

Referencias:

¹ Thermo Scientific. Smart Note: Orbital Shakers-Which Features are Important Considerations When Evaluating a Large Orbital Shaker for Production of Plasmid DNA Encoding Viral Vectors, for Applications Including CAR-T, Gene Therapy, or Other Genetic Engineering? https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LPD/Product-Information/Orbital-Shakers-DNA-Encoding-SmartNote-SNORBSHAKERDNA-EN.pdf

² Thermo Scientific. Application Note: Choosing the Right Orbital Shaker for Your Application. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D20064.pdf

³ Thermo Scientific. Application Note: Orbital Shaker Benchmarks-Best Practices for Use and Maintenance. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/Orbital-Shaker-Benchmarks-Best-Practices-App-Note-ANMAXQBEST.pdf

⁴ Thermo Scientific. Application Note: Optimization of Plasmid DNA Production in Escherichia coli Utilizing the Thermo Scientific MaxQ 8000 Incubated Stackable Shakers. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D19993~.pdf

⁵ Thermo Scientific. Application Note: DNA Preparation Using the Thermo Scientific Sorvall LYNX Superspeed Centrifuge Series. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D21231.pdf

⁶ Thermo Scientific. Instruction Manual: Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000/6000 Superspeed Centrifuge. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLED%2Fmanuals%2F50136519-h-Thermo%20Scientific%20Sorvall%20LYNX-en.pdf

⁷ Thermo Scientific. Centri-Log Plus Software: An Accurate and Reliable Data Management Solution. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLPD%2Fbrochures%2FCentriLog-Plus-Brochure-GLOBAL-FNL-FWR-1.pdf

⁸ Thermo Scientific. Technical Note: Proper Care and Maintenance for a Cell Culture Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Warranties/TNCO2CAREFEED-EN.pdf

⁹ Thermo Scientific. Smart Note: CO₂ Incubators-Smart Water for Your CO₂ Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/brochures/CO2-Incubator-Water-SmartNote-EN.pdf