Investigación sobre virus altamente patógenos utilizando seudotipos de virus
Introducción
Los nuevos virus, denominados virus emergentes, representan una amenaza para la salud humana de una magnitud que no debe subestimarse. Estos virus han adquirido la capacidad de infectar a los humanos ya sea como consecuencia de la transmisión entre especies o de cambios naturales en el genoma viral1. Las infecciones causadas por virus emergentes a menudo resultan en enfermedades graves o incluso la muerte, ya que el sistema inmunológico humano puede no ser capaz de combatir un virus desconocido, especialmente de origen zoonótico (ver la literatura para leer más2). Diversos factores promueven la aparición y propagación de virus emergentes3. Estos incluyen factores ecológicos, como la deforestación para ganar nuevas tierras para el desarrollo, así como nuestro estilo de vida que involucra movilidad global y comercio internacional. Así, la pérdida de hábitat aumenta la probabilidad de que las personas, las mascotas y los animales de granja entren en contacto con especies de vida silvestre que originalmente habitan áreas aisladas y, por lo tanto, no se habían encontrado anteriormente como huéspedes naturales de virus emergentes. Además, las circunstancias circundantes de una sociedad globalizada que implica un aumento de los viajes también permiten la diseminación de virus patógenos alrededor del mundo, incluso antes del inicio de los síntomas clínicos.
En los últimos 100 años, se han producido múltiples introducciones de virus emergentes en la población humana, lo que ha llevado a epidemias locales o brotes mundiales (pandemias; ver Tabla 1). En particular, el virus del Ébola ha suscitado recientemente preocupaciones en todo el mundo, ya que la epidemia del virus del Ébola en África Occidental, que cobró más de 11 000 vidas, demostró de manera devastadora el peligro que representan los virus emergentes4. La investigación que involucra virus emergentes a menudo está limitada a laboratorios de alta contención de niveles de bioseguridad (BSL) 3 y 4 (ver Tabla 1). Trabajar en laboratorios BSL-4 es altamente laborioso, costoso y permitido solo en unos pocos lugares, por lo que es difícil lograr un progreso científico rápido en la caracterización de patógenos virales y el desarrollo de medicamentos antivirales.
Dada esta situación, los pseudotipos virales ofrecen una opción atractiva para estudiar la entrada de virus altamente patógenos en las células de manera segura y eficiente. Esto es posible ya que no se analiza el patógeno completo, sino solo sus componentes que median la entrada en la célula huésped, las proteínas de la envoltura. Estas representan la clave para la entrada del virus en las células. En el caso de los pseudotipos virales, las proteínas de la envoltura de virus altamente patógenos se incorporan en un virus portador (pseudotipado), que no puede replicarse de manera autónoma, es decir, son deficientes en replicación. Los sistemas comúnmente utilizados para el pseudotipado se basan en rhabdovirus (por ejemplo, el virus de la estomatitis vesicular, VSV; Fig. 1) y retrovirus.
El objetivo de este estudio fue verificar si la entrada mediada por las proteínas de la envoltura de los pseudotipos virales refleja la entrada de virus intactos en las células huésped. Además, esta investigación fue diseñada para determinar qué influencia tiene el nivel de pureza de los reactivos utilizados, en este caso el agua de laboratorio, en la producción de pseudotipos virales.
Materiales y métodos
Cultivo celular, plásmidos de expresión y transfección: Las células HEK-293T, MDCKII y Vero E6 se incubaron en Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) y 1% de solución de penicilina/estreptomicina a 37°C y 5% de CO₂. Para el pase y la siembra, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se desprendieron mediante incubación con tripsina | EDTA.
Para producir pseudotipos de VSV, se utilizaron plásmidos de las siguientes proteínas de envoltura viral como vectores de expresión: glicoproteína VSV (VSV G), glicoproteína del virus Ébola (EBOV GP), glicoproteína de espiga del coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV S), hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) del virus de la influenza A responsable de la pandemia de 'gripe española', H1N1 (1918). Además, se empleó un plásmido de expresión para dipeptidil peptidasa 4 (DPP4). Se utilizó un plásmido de expresión vacío como control. Las células HEK-293T se transfectaron utilizando precipitación de calcio | fosfato, donde todos los tampones y soluciones se prepararon utilizando agua desmineralizada o agua ultrapura Sartorius Arium Pro VF.
Producción de agua ultrapura
El agua ultrapura Arium Pro VF utilizada se produjo como se describe en Nitzki y Herbig (2013)5. Esta agua tiene un contenido de TOC (carbono orgánico total, es decir, carbono orgánicamente ligado) de menos de 2 ppb y una conductividad de 0.055 μS/cm (corresponde a una resistividad de 18.2 MΩ × cm), compensada a 25°C.
Producción de pseudotipos de VSV
Para la generación de pseudotipos de VSV, se empleó un vector VSV deficiente en replicación en el que la información genómica para la glicoproteína VSV, VSV G, fue reemplazada por dos genes reporteros, es decir, marcos de lectura abiertos (ORFs) que codifican para la proteína verde fluorescente (GFP) y lla luciferasa de luciérnaga modificada (fLUC). Para propagar este virus (VSV*ΔG-fLUC), el VSV G debe ser proporcionado en trans (por ejemplo, mediante transfección de un plásmido de expresión). Los pseudotipos de VSV se produjeron como se describe en Hoffmann et al. (2016)6.
Pretratamiento de células diana con sialidasa o inhibidores
Las células MDCKII se trataron con 200 mU de sialidasa recombinante para eliminar los ácidos siálicos terminales de las glicoproteínas y glicolípidos de la membrana plasmática. Para probar si la entrada de pseudotipos de VSV mediada por proteínas de la envoltura en las células depende de un pH ácido y de la actividad de las cisteína proteasas celulares, las células Vero E6 se incubaron con 50 nM de bafilomicina A1 o 50 μM de E-64d. Los productos químicos empleados se diluyeron en medio de cultivo celular; la incubación se llevó a cabo durante 2 horas a 37°C y 5% de CO₂. Las células no tratadas sirvieron como controles.
Análisis de la entrada a la célula huésped mediada por la proteína de la envoltura:
Las células diana se incubaron con pseudotipos de VSV durante 1 hora antes de ser lavadas con PBS y posteriormente incubadas con medio de cultivo celular durante 16-20 horas. Luego, las células se lisaron utilizando un tampón de lisis de luciferasa, y la actividad de luciferasa en los lisados celulares se midió en un quimioluminómetro utilizando kits de ensayo disponibles comercialmente para evaluar la eficiencia de la transducción (es decir, la entrada en células huésped de pseudotipos) mediada por proteínas de la envoltura.
Resultados
Se sabe que el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV, anteriormente llamado coronavirus humano, EMC = hCoV-EMC), se une a la superficie celular a través de la interacción entre la glicoproteína de espiga viral (S) y la proteína de membrana celular dipeptidil peptidasa 4 (DPP4), permitiendo así la entrada en la célula7. Para confirmar si esto también se aplica en el contexto de los pseudotipos de VSV, se transfirieron células objetivo con un vector de expresión para DPP4 o un plásmido de expresión vacío (sin receptor). Como se esperaba, la expresión dirigida de DPP4 condujo a un aumento significativo en la entrada de pseudotipos de VSV en las células huésped si los pseudotipos tenían MERS-CoV S integrado en su envoltura (ver Fig. 2A).
Los virus de la influenza A, los agentes causantes de la enfermedad de la influenza, requieren estructuras de azúcar terminales, los llamados ácidos siálicos que ocurren como modificaciones naturales en las glicoproteínas y glicolípidos de la membrana celular, como receptores para mediar la entrada en las células objetivo (ver la literatura para leer más8). Para estudiar si la incorporación de proteínas de la envoltura viral de la influenza A en los pseudotipos de VSV también resulta en una entrada celular dependiente de ácidos siálicos, se emplearon pseudotipos de VSV con HA/NA de H1N1 (1918), y los ácidos siálicos se eliminaron enzimáticamente de las superficies de las células objetivo. Como se esperaba, la eliminación de los ácidos siálicos resultó en una disminución dramática en la entrada de pseudotipos de VSV en las células huésped que tenían HA/NA de H1N1 (1918) intregrado en su envoltura (ver Fig. 2B). Este hallazgo confirma que los pseudotipos virales reflejan el mecanismo de entrada de los virus de influenza A auténticos en las células.
La activación de la glicoproteína del virus del Ébola durante la entrada celular es dependiente del pH y requiere la actividad de proteasas de cisteína
La glicoproteína del virus del Ébola (EBOV GP) se modifica post-traduccionalmente para contener múltiples oligosacáridos, y se cree que esta densa agrupación de glicanos protege al virus de la detección eficiente por parte del sistema inmunológico humano9. Sin embargo, durante la entrada en la célula huésped, parte de la EBOV GP que lleva la mayoría de las modificaciones de azúcar debe ser eliminada10. Esta activación funcional es mediada por proteasas de cisteína celulares11 que están presentes en vesículas endosomales y sólo son activas a un pH endosomal bajo.
A continuación, investigamos si la entrada mediada por EBOV GP de los pseudotipos de VSV también depende de la actividad de las proteasas de cisteína celulares y de un pH bajo. Para este propósito, se produjeron pseudotipos de VSV con EBOV GP integrado en su envoltura y posteriormente se utilizaron para inocular células objetivo que previamente habían sido incubadas con bafilomicina A1 (previene la acidificación dentro de los endosomas mediante el bloqueo de la bomba de protones) o un inhibidor de proteasa de cisteína (E-64d). Esto mostró que la entrada celular mediada por EBOV GP en el contexto de pseudotipos de VSV también depende de un ambiente ácido (ver Fig. 3A) y de la actividad de las proteasas de cisteína (ver Fig. 3B). Además, también pudimos demostrar que el tratamiento con E-64d bloquea específicamente la entrada celular impulsada por EBOV GP, ya que el pseudotipo mediado por VSV-G es independiente de las proteasas de cisteína, aunque depende del pH endosomal bajo.
El nivel de pureza del agua de laboratorio utilizada influye en la calidad de los pseudotipos de VSV
Después de que se pudiera demostrar en los ensayos previos que los pseudotipos de VSV son modelos adecuados para estudiar la entrada de virus altamente patógenos en las células huésped, el siguiente problema a aclarar fue la influencia particular que el nivel de pureza del agua de laboratorio utilizada tiene en la calidad de los pseudotipos de VSV. Durante la producción de pseudotipos de VSV, se emplean varios tampones y soluciones que se preparan con agua. Sin embargo, se debe tener en cuenta que no cualquier tipo de agua es suficiente para la preparación de estos reactivos. Más bien, se debe hacer la elección correcta del nivel de pureza para el uso en laboratorio.
Para investigar si el uso de agua ultrapura produce pseudotipos de VSV de mayor calidad, se generaron dos lotes de pseudotipos de VSV en un experimento paralelo: un lote se preparó utilizando agua desmineralizada de una fuente de suministro de agua de laboratorio central (conductividad de 3,7 – 4,1 μS/cm a 19 °C) como disolvente básico para todas las soluciones y tampones, mientras que se generó otro lote utilizando soluciones y tampones basados en agua ultrapura Arium Pro VF (conductividad de 0,055 μS/cm compensada a 25 °C). Se examinaron EBOV GP y MERS-CoV S como proteínas de envoltura. Tras la producción paralela de pseudotipos de VSV manteniendo condiciones de incubación idénticas, se inocularon las células diana y se cuantificó la entrada mediada por la proteína de envoltura de los pseudotipos de VSV.
Esta configuración experimental demostró que la entrada la célula huesped (como parámetro del grado de calidad) de los pseudotipos de VSV producidos utilizando agua ultrapura Arium Pro VF como disolvente básico para todos los tampones y soluciones era significativamente superior en comparación con la de los pseudotipos para cuya producción se empleó agua desmineralizada (Fig. 4).
Discusión
Durante este estudio, se produjeron pseudotipos virales basados en un virus de estomatitis vesicular (VSV) deficiente en replicación, y se estudiaron las proteínas de la envoltura de varios virus altamente patógenos. Mostramos que la entrada en las células huésped dependía de moléculas receptoras idénticas y de procesos bioquímicos como se describe para los virus auténticos. Además, demostramos que el uso de agua ultrapura para la producción de pseudotipos de VSV resultó en una optimización de este proceso. Las investigaciones futuras deberían diseñarse para aclarar en qué se basa esta observación: ¿se debe a una mayor cantidad de pseudotipos de VSV producidos, a una entrada celular más eficiente o a una estabilidad mejorada de los pseudotipos? Por ejemplo, podemos especular que la ausencia de sales, proteinasas o lipasas cuando se utiliza agua ultrapura aumenta la estabilidad de los pseudotipos de VSV.
En conclusión, se puede afirmar que los pseudotipos virales son herramientas importantes para investigar la entrada en las células huésped de virus altamente patógenos. Como estos pseudotipos virales no restringen la investigación sobre tales virus altamente patógenos a laboratorios BLS-3 o BLS-4, esto permite que un mayor número de instalaciones científicas realicen dichas investigaciones.
Como resultado, la entrada celular de virus emergentes puede caracterizarse y pueden desarrollarse más rápidamente procedimientos de detección adecuados y estrategias antivirales (medicamentos, vacunas). El uso de pseudotipos también reduce la considerable intensidad laboral involucrada en laboratorios de alta contención que requieren trajes de protección de cuerpo entero, así como los considerables costos y las limitaciones que implica dicho trabajo en laboratorio (por ejemplo, no tener acceso a equipos que no están ubicados directamente dentro del laboratorio de alta contención). Además, en comparación con los virus auténticos y altamente patógenos, los pseudotipos virales minimizan el riesgo de infección del personal de laboratorio tras una exposición no intencionada, representando así un aspecto de seguridad significativo.
La optimización del proceso de producción, por ejemplo, mediante el uso de reactivos de alta pureza, particularmente aquellos basados en agua, puede contribuir adicionalmente a mejorar la sensibilidad de los procedimientos de prueba subsiguientes, aumentar las cantidades de producción y así reducir aún más los costos de producción.
Referencias
1 Li, W. et al. Animal origins of the severe acute respiratory syndrome coronavirus: Insight from ACE2-Sprotein interactions. Journal of Virology 2016; 80: 4211–4219.
2 Mandl, J. et al. Reservoir host immune responses to emerging zoonotic viruses. Cell 2015; 160: 20–35.
3 Morse, S. S. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerging Infectious Diseases 1995; 1: 7–15.
4 Shiwani, H. A. et al. An update on the 2014 Ebola outbreak in Western Africa. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2017; 10: 6–10.
5 Nitzki, F., Herbig, E. In situ Hybridisierung – Die Bedeutung von Reinstwasser für RNA Technologien”, GIT Labor-Fachzeitschrift 57. Jahrgang, 3; 2013 [también disponible en inglés: In Situ Hybridization: The Importance of Ultrapure Water for RNA Technologies].
6 Hoffmann, M. et al. The glycoproteins of all filovirus species use the same host factors for entry into bat and human cells but entry efficiency is species dependent. PLoS One; 2016, Vol. 11.
7 Raj, V. S. et al. Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-EMC. Nature 2013; 495: 251–254.
8 De Graaf, M., Fouchier, R. A. M. Role of receptor binding specificity in influenza A virus transmission and pathogenesis. The EMBO Journal 2014; 33: 781–935.
9 Cook, J. D., Lee, J. E. The secret life of viral entry glycoproteins: Moonlighting in immune evasion. PLoS Pathogens 2013; Vol. 9.
10 White, J. M., Schornberg, K. L. A new player in the puzzle of filovirus entry. Nature Reviews Microbiology 2012; 10: 317–322.
11 Chandran, K. et al. Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science 2005; 308: 1643–1645.
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