Recolección y clarificación a escala de laboratorio de vectores lentivirales mediante sistemas de filtración de laboratorio Sartoclear Dynamics
Introducción
Con el advenimiento de la terapia génica y la terapia celular modificada genéticamente, los virus se han convertido en herramientas críticas en la medicina. La terapia génica tiene un potencial terapéutico significativo para el tratamiento de muchas enfermedades hereditarias y adquiridas1, con tres mil ensayos clínicos con vectores virales registrados como en curso, de los cuales aproximadamente el 10 % se realizan con vectores lentivirales2. Actualmente, se están desarrollando más de dos mil productos únicos de células modificadas genéticamente, y ya se han aprobado cuatro terapias CAR-T para abordar indicaciones oncológicas. La prometedora perspectiva de los ensayos clínicos en curso sobre terapia génica y terapia celular modificada genéticamente3,4 significa que existe una gran demanda de métodos escalables y rentables para la producción y purificación de vectores virales5.
Los vectores lentivirales (LV) se producen típicamente mediante transfección transitoria de células HEK293T con múltiples plásmidos vectoriales6,7. El virus se libera en el sobrenadante; por lo tanto, las células deben eliminarse del caldo de cultivo celular. Uno de los desafíos en la investigación CAR-T es la falta de un método establecido para la clarificación de LV que se considere el estándar de oro. El objetivo del proceso de clarificación es eliminar los principales contaminantes y reducir la turbidez de la solución, manteniendo la actividad del virus. La clarificación a escala de laboratorio se realiza típicamente mediante centrifugación del caldo de fermentación y se complementa con la microfiltración subsiguiente del sobrenadante1,8,9. Simplificar la cosecha y la clarificación mediante el uso de una filtración de membrana de un solo paso, que se puede lograr mediante el uso de ayudas de filtración, mejoraría la eficiencia de la purificación de LV y la transducción de células T.
Para simplificar los flujos de trabajo de investigación de CAR-T, la solución de cribado de células T de Sartorius ofrece una forma multiplexada semiautomatizada para el descubrimiento de nuevos objetivos y el desarrollo de constructos CAR eficientes (Figura 1). En particular, la serie de productos de filtración Sartoclear Dynamics Lab, utilizados para la clarificación del caldo de cultivo celular, se desarrolló para facilitar un flujo de trabajo rápido y eficiente de cosecha de vectores virales y se basa en el principio de filtración dinámica por alimentación de cuerpo. La ayuda de filtración de tierra de diatomeas (DE) consiste en restos esqueléticos fusionados de diatomeas con una estructura altamente porosa10. Después del proceso ascendente, el caldo de cultivo se mezcla primero con una ayuda de filtración y luego se aplica a una membrana filtrante. La DE forma un pastel poroso casi incomprimible, y su alta porosidad permite que el líquido fluya alrededor de las partículas, evitando la obstrucción del filtro11. El uso de ayudas de filtración elimina el paso de centrifugación y reduce el tiempo de procesamiento.
Materiales y métodos
El vector lentiviral se expresó mediante transfección transitoria de células HEK293T/17 SF, cultivadas en suspensión utilizando el biorreactor de un solo uso UniVessel de 2 L (Sartorius), con cuatro plásmidos que codifican los genes lentivirales esenciales, como se describe en detalle por Labisch et al12.
La clarificación de 50 mL de muestras de caldo de cultivo de LV se realizó utilizando la versión de polietersulfona (PES) de 0,45 μm Sartoclear Dynamics Lab V50 (Sartorius). El kit Sartoclear Dynamics Lab V50 contiene unidades de filtración al vacío Sartolab RF50, que constan de un embudo, un tubo cónico de 50 mL y un conector de tubo para la conexión al vacío. El kit se suministra con una opción de cantidades estándar de 1 g de DE (Sartorius, SDLV-0050-01F0-2) o 2 g de DE (Sartorius, SDLV-0050-02F0-2) para la filtración de hasta 50 mL. Se probaron concentraciones de DE entre 5 g/L y 40 g/L de caldo de cultivo celular. Se añadió DE a 50 mL del caldo de cultivo celular y se mezcló para obtener una suspensión homogénea, que luego se pasó inmediatamente a través de los filtros. Además, la clarificación de 50 mL de caldo de cultivo celular se realizó sin DE en un método de dos pasos de 5 minutos de centrifugación a 800 x g y filtración subsecuente a través de un Sartolab RF50 con una membrana PES de 0,45 μm (Sartorius, 180F01---------2). Para la determinación de la capacidad del filtro, la clarificación se realizó hasta que se produjo la obstrucción del filtro y se determinó el volumen del filtrado. La filtración al vacío se realizó con el Sartolab MultiStation (Sartorius, SDLC01), que es un soporte diseñado específicamente para sostener de una a seis unidades de filtración al vacío Sartolab RF50, permitiendo la filtración simultánea de hasta seis muestras.
Se realizó un enfoque de diseño de experimentos (DOE) para optimizar las condiciones de clarificación. La concentración de DE se varió entre 5 g/L, 12,5 g/L y 20 g/L y el tiempo de contacto de DE entre 0 min, 10 min y 20 min. Los experimentos se planificaron como un diseño factorial completo con cuatro puntos centrales y se evaluaron utilizando el software MODDE™ (Sartorius). Los parámetros analíticos empleados para determinar el rendimiento de clarificación fueron los siguientes: medición de la turbidez utilizando un medidor de turbidez Orion™ AQUAfast AQ3010 (Thermo Fisher Scientific); concentración total de dsDNA (Quant-iT™ PicoGreen™ Assay, Thermo Fisher Scientific); y concentración total de proteínas (kit de ensayo de proteínas Pierce™ Coomassie Bradford, Thermo Fisher Scientific) antes (material centrifugado) y después de la filtración. Además, el título de partículas de LV se determinó realizando un p24-ELISA (QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit, Cell Biolabs). El título de partículas lentivirales infecciosas se midió mediante la transducción de células HEK293T adherentes con muestras de virus y la medición de la expresión del transgén (constructo CD19-CAR) mediante citometría de flujo con el iQue Screener PLUS (Sartorius), como se describió anteriormente12.
Resultados y discusión
Evaluación del impacto de la concentración de DE y del tiempo de contacto con DE sobre la turbidez, el título infeccioso y el tiempo de filtración en un estudio DOE con MODDE
Para investigar el efecto de la DE en la clarificación de LV, se seleccionaron los factores de concentración de DE y tiempo de contacto con DE para un enfoque DOE, con el fin de evaluar la influencia de estos parámetros en la turbidez, el título infeccioso y el tiempo de filtración. La densidad total de células en el caldo de cultivo celular utilizado para las corridas de filtración del DOE fue de 3,7 x 106 células/mL con una turbidez de 382 NTU.
La Figura 2 muestra que las respuestas que comprenden el título infeccioso y el tiempo de filtración solo se ven afectadas por el factor de concentración de DE. A medida que aumenta la concentración de DE, el título infeccioso disminuye linealmente. Para el tiempo de filtración, existe un término cuadrático para la concentración de DE, lo que resulta en una reducción del tiempo de filtración a medida que la concentración de DE en el rango de prueba de concentración definida aumenta. La turbidez se redujo linealmente a medida que se extendía el tiempo de contacto de la muestra con DE. Además, con el aumento de la concentración de DE, la turbidez disminuyó, siendo este último el factor con el mayor efecto.
Evaluación del impacto del Sartoclear Dynamics Lab V50 en el tiempo de procesamiento
La manipulación del kit Sartoclear Dynamics Lab V50 con diferentes concentraciones de DE se comparó con la microfiltración del sobrenadante centrifugado utilizando el Sartolab RF50 (método estándar de dos pasos). Al cosechar la cultura celular, la densidad celular para los experimentos de manipulación fue de 1,11 x 106 células/mL y la turbidez fue de 141 NTU. El tiempo total de procesamiento se desglosó en tiempo de preparación (es decir, medir los volúmenes de cultivo, eliminar el sobrenadante después de la centrifugación, pesar la DE y agregar la DE a la suspensión celular), tiempo de centrifugación y tiempo de filtración.
Durante la clarificación del sobrenadante centrifugado, el primer filtro Sartolab RF50 se obstruyó después de aproximadamente 25 mL. Por lo tanto, se requirió un segundo filtro Sartolab RF50, por lo que la solución no filtrada restante tuvo que transferirse a un segundo filtro, lo que hizo que la manipulación fuera laboriosa y complicada en general. El uso de Sartoclear Dynamics Lab V50 redujo el tiempo total de preparación, ya que elimina la necesidad de un paso de centrifugación (Figura 3A). El uso de Sartoclear Dynamics Lab V50 redujo el tiempo de manipulación 3,8 veces en comparación con el método estándar. El tiempo de filtración dependía de la concentración de DE; fue de 25 s para 5 g/L y bajó a 13 s para 60 g/L (Figura 3B).
Evaluación del impacto del Sartoclear Dynamics Lab V50 en la turbidez y capacidad del filtro
La clarificación se realizó con Sartoclear Dynamics Lab V50 y 5 g/L DE o con el método convencional de dos pasos Sartolab RF50 que implica la centrifugación del caldo de cultivo celular y la filtración subsiguiente. El caldo de cultivo celular que contiene lentivirus utilizado para la determinación de la capacidad del filtro tenía una densidad celular total de 3,7 x 106 células/mL y una turbidez de 398 NTU en el momento de la cosecha.
Según la Figura 4A, el método de clarificación en dos pasos que combina centrifugación y filtración (método estándar) resulta en una turbidez significativamente mayor de 43 NTU (reducción del 89 %), mientras que el Sartoclear Dynamics Lab V50 redujo la turbidez en un 95 % hasta 21 NTU. Las capacidades de filtración se determinaron utilizando solo una concentración mínima de DE de 5 g/L con Sartoclear Dynamics Lab V50 para la clarificación. La filtración se continuó hasta que se produjo la obstrucción del filtro. La realización del método convencional a escala de laboratorio de centrifugación para la eliminación de células y la clarificación del sobrenadante resultó en una rápida obstrucción del filtro justo después de 33 mL. El uso de 5 g/L de DE como ayuda de filtración aumentó enormemente el volumen máximo de filtración, permitiendo que el volumen máximo filtrable del dispositivo de filtración de 50 mL utilizado se superara en más del doble. Las capacidades de filtración aumentaron significativamente cuando se utilizó 5 g/L de DE (Figura 4B). Por el contrario, las capacidades de filtración fueron bajas cuando se realizó la clarificación convencional mediante centrifugación y filtración subsiguiente (15 L/m²). Cuando se utilizó 5 g/L de DE, las capacidades de filtración aumentaron a aproximadamente 63 L/m². Después de la clarificación con DE, se encontró que el título infeccioso de LV fue típicamente del 75 % o más en comparación con el material centrifugado.
Evaluación del impacto del Sartoclear Dynamics Lab V50 en la eliminación de impurezas
En un experimento separado, se analizó el potencial del Sartoclear Dynamics Lab V50 para eliminar impurezas relacionadas con el proceso mediante la cuantificación de la eliminación total de proteínas y dsDNA (Figura 5).
Una concentración de DE de hasta 10 g/L aumentó la eliminación de proteínas y dsDNA, pero concentraciones más altas de DE entre 10 g/L y 40 g/L no llevaron a una mejora adicional en la eliminación de impurezas. Por el contrario, el uso de Sartoclear Dynamics Lab V50 resultó en una eliminación significativamente mayor de impurezas en comparación con el método estándar de centrifugación y filtración en dos pasos.
Conclusión
Los sistemas de filtración Sartoclear Dynamics Lab permiten la clarificación de cultivos celulares de mamíferos que contienen LV sin la necesidad de centrifugación. En comparación con el método estándar, el Sartoclear Dynamics Lab V50 resultó en una mejor reducción de la turbidez, una mayor eliminación de contaminantes y una mayor capacidad de la membrana. Esto subraya la idoneidad de los sistemas de filtración Sartoclear Dynamics™ Lab para la cosecha y clarificación de vectores lentivirales. Sin embargo, la concentración de DE debe ajustarse para recuperar altos rendimientos de LV y evitar la pérdida de rendimiento debido a una cantidad inapropiadamente alta de DE seleccionada. El kit Sartoclear Dynamics Lab V50 con DE permite al técnico de laboratorio realizar una filtración clarificadora de un solo paso que no solo facilita una manipulación más rápida y segura, sino que también reduce la cantidad de materiales de laboratorio utilizados. El kit permite seleccionar una cantidad optimizada de DE que aumenta considerablemente la capacidad del filtro, asegurando así un proceso de clarificación de lentivirus eficiente y robusto en la terapia génica y la terapia celular modificada genéticamente.
Referencias
1 Segura, M. M., Kamen, A. A., and Garnier, A. 2011. Overview of current scalable methods for purification of viral vectors. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 737, 89–116.
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3 Hanna, E., Rémuzat, C., Auquier, P., and Toumi, M. 2017. Gene therapies development: slow progress and promising prospect. Journal of market access & health policy 5, 1, 1265293.
4 Herzog, R. W., Cao, O., and Srivastava, A. 2010. Two decades of clinical gene therapy--success is finally mounting. Discovery medicine 9, 45, 105–111.
5 Ruscic, J., Perry, C., Mukhopadhyay, T., Takeuchi, Y., and Bracewell, D. G. 2019. Lentiviral Vector Purification Using Nanofiber Ion-Exchange Chromatography. Molecular therapy. Methods & clinical development 15, 52–62.
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7 Sakuma, T., Barry, M. A., and Ikeda, Y. 2012. Lentiviral vectors: basic to translational. The Biochemical journal 443, 3, 603–618.
8 Bauler, M., Roberts, J. K., Wu, C.-C., Fan, B., Ferrara, F., Yip, B. H., Diao, S., Kim, Y.-I., Moore, J., Zhou, S., Wielgosz, M. M., Ryu, B., and Throm, R. E. 2020. Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-free Media. Molecular therapy. Methods & clinical development 17, 58–68.
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10 Bakr, H. E. G. M. 2010. Diatomite: Its Characterization, Modifications and Applications. Asian J. of Materials Science 2, 3, 121–136.
11 Grauf, M., Lagrange, B., and Schöne, K. 2018. Simplified Small-Scale Harvest of CHO Cells for mAb Analytics. Genetic Engineering & Biotechnology News 38, 5, 22– 23.
12 Labisch, J. J., Bollmann, F., Wolff, M. W., and Pflanz, K. 2021. A new simplified clarification approach for lentiviral vectors using diatomaceous earth improves throughput and safe handling. Journal of biotechnology, 326, 11–20.
Abreviaciones
CAR - Receptor de antígeno quimérico
(ds)DNA - Ácido desoxirribonucleico (doble cadena)
DE - Tierra de diatomeas
DOE - Diseño de experimentos
HEK - Células de riñón embrionario humano
LV - Vector lentiviral
PES - Polietersulfona
TU - Unidades de transducción
VP - Partículas virales
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